Evaluación de la posible presencia de contaminantes en el agua corriente: Un análisis de la mitosis en






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fecha de publicación11.03.2016
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Evaluación de la posible presencia de contaminantes en el agua corriente: Un análisis de la mitosis en Allium cepa (cebolla)

Fundamentación

La mitosis es un proceso que ocurre en el núcleo de las células eucariotas y que precede inmediatamente a la división celular, consistente en el reparto equitativo del material hereditario (ADN) característico (Rubenstein y Wick, S., 2008). La mitosis cumple un rol fundamental durante el ciclo celular, y los cambios en cada fase pueden mostrar alteraciones que indiquen situaciones de contaminación, estrés, entre otros, que pueden ser producidos por factores ambientales o por la infección de organismos patógenos (hongos, bacterias u otros).

Se conoce que en la cuidad de Pilar, (Buenos Aires, Argentina) existen napas de algunas zonas que están contaminados con metales pesados. Recientemente se ha publicado en el diario La Nación1 una denuncia sobre contaminación en barrios de Pilar. En este contexto, se propone realizar bioensayos con Allium cepa incubada con agua de red para observar si existe algún cambio en el porcentaje de células en las distintas fases mitóticas, o en la morfología celular debido a la presencia de algún contaminante. Estos resultados serán comparados con cebollas incubadas en agua mineral. La evaluación del estado de agua potable de una localidad es de suma importancia ya que se trata de agua de red que los habitantes de una localidad consumen diariamente y la contaminación de la misma puede traer inconvenientes en la salud clasificables desde leves a profundos. Si bien las autoridades municipales realizan las pruebas necesarias para asegurar que el agua de red se encuentre en niveles de contaminantes no significativos para la salud, es importante recordar que localmente estas pruebas pueden variar debido al almacenamiento del agua de red en tanques hogareños e inclusive por existencia de filtraciones en las cañerías de distribución que pueden no ser detectadas rápidamente. En este sentido el aporte que puede realizarse desde este sencillo estudio puede ser significativo y tomarse sus resultados, en caso de ser negativos, como una llamada de atención para la profundización en la realización de pruebas químicas de mayor confiabilidad.

Introducción

En los últimos años se observa un creciente interés por el desarrollo y empleo de pruebas biológicas para evaluar los potenciales efectos tóxicos y genotóxicos de la contaminación sobre los seres humanos y los ecosistemas (Morais Lemes y Marin Morales, 2009).

Cuando un bulbo de cebolla (Allium cepa) se rehidrata, se produce una estimulación del crecimiento de las células, lo cual permite la elongación de las raíces de la planta. Sin embargo, cuando la hidratación se lleva a cabo en presencia de sustancias tóxicas, la división celular de los meristemos radiculares puede inhibirse, ya sea retardando el proceso de mitosis o destruyendo las células. Este tipo de alteraciones generalmente impide el crecimiento normal de la raíz y, por tanto, su elongación (Fiskesjö, 1985,1993, 1997). La genotoxicidad también puede evidenciarse en cambios morfológicos de la células, como por ejemplo la aparición de micronúcleos, aparición de puentes o cromosomas errantes, anafase desorganizadas, aumento del tamaño del núcleo y/o nucléolo, núcleos lobulados, células polinucleadas (Andrioli, et al. 2006). Desde hace varias décadas se utiliza en el monitoreo ambiental A. cepa ya que ha resultado un excelente bioindicador de genotoxicidad y efectos mutagénicos (Freyre et al, 2009, Andrioli, et al. 2006). Por otra parte, es un ensayo de reducido costo, rápida evaluación de resultados y amplia disponibilidad del material biológico, siendo su mayor ventaja la fácil observación de los núcleos al microscopio lo que favorece la evaluación e interpretación de las observaciones.

En la localidad de Pilar de la Provincia de Buenos Aires, se han detectado niveles altos de cromatos, nitratos y arsénico en las aguas provenientes de agua de pozos1,2. Estas evidencias indicarían que probablemente las mismas no sean aptas para el consumo humano.

Según el Código Alimentario Argentino, el máximo permitido de arsénico es de 0,010 mg/litro. En los casos denunciados, llegan al 0,029 y 0,040 mg/l. En el caso de los nitratos, el valor máximo aceptado es de 45 mg/l y los informes privados detectaron que llega a los 60 mg/l.2

Se presume que al estar las aguas de Pilar contaminadas con distintos agentes tóxicos, estos mismos tendrán efectos sobre el crecimiento de las raíces de las cebollas incubadas, y también se verán afectados los porcentajes porcentaje de células en las distintas fases mitóticas de células de Allium cepa comparando siempre con el control de agua mineral.

En un ensayo realizado en la Cuidad de México, en el cual se estudió la presencia de contaminantes en las aguas y su relación con la mutagénesis, no se observó una correlación entre el índice de división mitótica, el porcentaje de las fases en las que se hallaban las células y la presencia de contaminantes en el agua. Los porcentajes entre agua testigo y problema presentaron valores semejantes. (SIDALIN, CCH Plantel Oriente-Evaluación genotoxicológica de dos muestras de agua usando Allium test- Cuidad de México, 2012). La ausencia de efectos genotóxicos apreciables en esto bioensayos no implica que las aguas sean potables para el consumo humano ya que otros factores pueden estar involucrados que no muestran efectos en A. cepa. Se acepta en general una confiabilidad del 80 % versus otros sistemas de prueba (Andrioli, et al, 2006)

Pregunta de investigación: ¿Existirán diferencias en el porcentaje de células en las distintas fases mitóticas de células de Allium cepa incubada en agua corriente comparada con las incubadas en agua mineral? ¿Se observarán cambios morfológicos (tamaño del núcleo, del nucléolo o de la célula) entre los dos grupos experimentales? ¿Se observarán diferencias en la longitud de las raíces incubadas durante los tres días)

Variable Independiente: Fases de la mitosis en las cebollas incubadas, tipo de agua (agua corriente y agua mineral), tiempo de incubación (tres días)

Variable Dependiente: Porcentaje de células en cada fase de mitosis en los dos tratamientos utilizados (agua mineral y una corriente). Crecimiento total de las raíces (cm)

1Diario La Nación- 10 de Agosto 2000 http://www.lanacion.com.ar/28230-denuncian-que-hay-contaminacion-en-barrios-de-pilar)

2http://www.minutouno.com/notas/129875-aguas-contaminadas-encountries-pilar- Nota publicada el 30 de Noviembre del 2001- Diario onlin e Minuto Uno.

Variables de control y Métodos de control

  • Tamaño y origen de las cebollas puestas a incubar:

Las cebollas fueron compradas el mismo día y en el mismo lugar, se pesaron y seleccionaron cebollas de 150 g±10g utilizando una balanza NUTRI 100 (± 1g)

  • Tiempo total de incubación ( 3 días) y Hora en la que se inicia y finaliza la incubación:

La hora de inicio de la incubación fue a las 10:00 hs (AM) debido a que en este horario es el punto máximo de la mitosis. Se finalizó a las 72 horas de incubación que se midió con un cronómetro.

  • Volumen de agua utilizado en cada incubación y origen del agua utilizada en la incubación:

El volumen de agua de incubación fue medido con probeta de 100 cm3±1cm3. La medición se realizó utilizando agua corriente extraída en cada ocasión de la misma canilla del laboratorio y agua mineral Villavicencio de 2000 cm3 fueron comprada en el Market Pilar.

  • Temperatura de incubación de las cebollas:

La incubación fue realizada a temperatura ambiente del laboratorio (entre 22 y 24ºC) Para evitar cambios bruscos los vaso de incubación fueron introducidos en un baño térmico donde se midió la temperatura con un termómetro digital SEM 200 (± 0,1ºC)

  • Microscopio y objetivo de observación:

Se utilizó el mismo microscopio marca DIG con un aumento 100 X con una superficie de ocular de 0.1 cm2.

  • Número de célula observadas por cada raíz y número total de raíces observadas por cada tratamiento:



Se contaron 50 células al azar en total para cada raíz y se observaron cinco raíces por cada tratamiento, en total se observaron 500 células (250 células por tratamiento)

  • Volumen de reactivos utilizados en la preparación de los preparados permanentes de las raíces:

Se utilizaron 2 cm3 de HCl 1N y 2 cm3 de Carnoy, medidos midieron con pipeta de 5cm3 (±0,1 cm3) y 3 gotas de Orceina

  • Tiempo de incubación con el colorante temperatura de incubación:

El tiempo de incubación con el colorante fue medido con cronómetro digital cronometrado durante 15 minutos (CRONOS ± 0,001 s) y la temperatura de incubación a 60ºC se controló con una baño térmico y termómetro digital SEM 200 (± 0,1ºC)

  • Longitud inicial y final de la raíces:

Se estableció utilizar las raíces con crecimiento de 0,2 cm iniciales que fueron medidos con un calibre de plástico (± 0,05 cm) y la longitud final al término de la experiencia se midió utilizando el mismo calibre

MATERIALES Y MÉTODOS

Se obtuvieron cebollas (Allium cepa) y el agua mineral de un supermercado de Pilar. Las cebollas fueron trasladadas al laboratorio el mismo día de la compra donde se cepillaron, lavaron y pesaron utilizando una balanza NUTRI 100 (± 1g). Se seleccionaron cebollas de 150 g ±10g.

Se incubaron cinco cebollas con agua mineral Villavicencio (control) y 5 cebollas con agua de red obtenida de una de las canillas del laboratorio. El volumen de agua de incubación fue de 100 cm3, medido con probeta volumétrica. Se midió, previa a la incubación, la longitud inicial de 5 raíces en cada una de las cinco cebollas de cada tratamiento. La longitud tomada para el muestreo inicial se fijó en 0,2 cm de crecimiento inicial. Las raíces seleccionadas fueron las cercanas al centro de la cada cebolla y se cortaron las raíces adyacentes para no confundir el seguimiento al finalizar la observación. .

A continuación se utilizaron 5 vasos de precipitados por tratamiento, y se colocaron 100 ml de agua mineral o de red según corresponda. En cada vaso se colocó una cebolla. (Figura 1) y a su vez los vasos fueron colocados en un baño térmico con un termómetro para evitar cambios bruscos en la temperatura de incubación durante los días siguientes.

La incubación fue por 72 horas y al finalizar se retiraron las cebollas del agua, se registró la longitud final de las raíces seleccionadas y se cortaron enteras de cada cebolla.

imgp1732.jpg

Figura 1- Dispositivo utilizado para hacer la incubación. En el vaso de precipitados se coloca agua mineral o agua de red, según el tratamiento que corresponda, y se incuba las cebollas por 72 horas.

Las raíces fueron colocadas en tubos de ensayo junto con 2 ml de acido clorhídrico 1N y 2 cm3 Carnoy (3:1 etanol- ácido acético). Los tubos de ensayo se colocaron en baño maría a 60º C por 15 minutos, al cabo del cual las raíces fueron retiradas del baño y eliminado el HCl y el Carnoy, con tres lavados con agua destilada. En los mismos tubos, se colocaron 3 gotas de orceina por 15 minutos.

Con una pinza se tomaron las raíces y se colocaron sobre el portaobjetos. Se cortó la punta de cada una y se cubrió con cubreobjetos, haciendo presión, de manera de disgregar la raíz. Luego se observó al microscopio a 100X.

El porcentaje de incremento del crecimiento de raíces (ICR) se calculó de acuerdo con:

ICR = ((LF-LI)/LI) *100 (1)

DONDE:

ICR = porcentaje de incremento del crecimiento de las raíces medidos entre el día 1 y el día 3y expresado en porcentaje.

LI = longitud inicial de las raíces en la hora cero de incubación y expresado en cm

LF = longitud final de las raíces a las 72 horas de iniciada la incubación y expresado en cm

Se seleccionó una cebolla por cada tratamiento a las que se efectuó la tinción en cinco de las raíces (en total 10 raíces) y la posterior observación al microscopio de las mitosis en cada caso. Se realizó una observación de 250 células totales entre ambos tratamientos. Para realizar el cálculo del índice mitótico y del índice de células en cada fase de la división celular se utilizaron las siguientes ecuaciones



(2)

(3)

Los resultados se compararon mediante las barras de error, correspondientes a los desvíos estándar de cada muestra, los cuales se analizaron mediante un gráfico de barras. La longitud de las raíces se comparó como porcentaje de crecimiento relativo al control (agua mineral). Los valores en cado caso se analizaron utilizando un t-Student.

Resultados

Crecimiento radicular: En la Tabla 1 se presentan los datos de crecimiento radicular al cabo de 72 horas de incubación de A. cepa en agua corriente y agua mineral. Los resultados muestran en general baja dispersión en ambos tratamientos respecto del promedio. En ambos tratamientos se observaron dramáticos incrementos de porcentajes de crecimiento siendo mayores para las cebollas incubadas en agua corriente (calculados de acuerdo con ecuación 1, Tabla 2). En este último caso se evidenció hasta 990% de crecimiento respecto de la longitud inicial de las raíces mientras que para el agua mineral el valor máximo fue de 900% (Fig. 2).

Tabla 1: Longitudes iniciales y finales de cebollas (A. cepa) incubadas en agua mineral (tratamiento control) y agua corriente.

C1, C2, C3, C4 Y C5: cebollas incubadas en cada tratamiento, en cada una de las celdas se anota el valor inicial y final de la longitud de cada raíz LONG INI. Longitud inicial en la hora cero de incubación, LONG FIN. Longitud final de cada una de las raíces en la hora 72 y final del experimento. PROM C1 a C5: promedios de crecimiento de 5 raíces en la cebolla 1 (C1), cebolla 2 (C2), cebolla 3 (C3), cebolla 4 (C4) y cebolla 5 (C5).

Tratamiento

C1

(cm±0,05cm)

C2

(cm±0,05cm)

C3

(cm±0,05cm)

C4

(cm±0,05cm)

C5

(cm±0,05cm)

Promedio General ±SD

LONG.INI MINERAL

(N=5)

0,21

0,21

0,20

0,20

0,22

0,20

0,20

0,21

0,22

0,23

0,20

0,22

0,21

0,23

0,24

0,20

0,20

0,22

0,21

0,22

0,20

0,21

0,20

0,21

0,21




PROM C1 a C5 ±SD

0,21±0,01

0,22±0,01

0,21±0,01

0,22±0,01

0,21±0,01

0,21±0,01

LONG.FIN

MINERAL

(N=5)

1,80

1,80

1,81

1,82

1,80

1,74

1,75

1,75

1,75

1.74

1,78

1,78

1,77

1,75

1,76

1,88

1,89

1,87

1,89

1,88

2,10

2,10

2,08

2,00

2,10




PROM C1 a C5 ±SD

1,80±0,01

1,75±0,01

1,77±0,02

1,88±0,02

2,01±0,01

1,86±0,14

LONG. INI

CORRIENTE

(N=5)

0,20

0,21

0,20

0,22

0,20

0,22

0,22

0,21

0,20

0,20

0,22

0,25

0,22

0,21

0,21


0,22

0,22

0,21

0,20

0,20

0,22

0,22

0,21

0,20

0,20




PROM C1 a C5 ±SD

0,21±0,01

0,22±0,01

0,21±0,01

0,22±0,01

0,21±0,01

0,22±0,02

LONG.FIN

CORRIENTE

(N=5)

1,92

1,92

1,90

1,93

1,90


2,10

2,10

2,00

2,00

2,11

2,12

2,15

2,16

2,15

2,18

2,10

2,10

2,00

2,00

2,11

2,12

2,15

2,16

2,15

2,18

2,07±0, 11

PROM C1 a C5 ±SD

1,91±0,02

2,06±0,03

2,15±0,02

2,01±0,01

2,15±0,02




TABLA 2: Porcentaje de incremento de crecimiento de las cebollas incubadas en agua mineral (control) y agua corriente.

Se presenta en cada caso el incremento calculado con la ecuación 1 correspondiente al promedio de cinco raíces para cada cebolla de cada tratamiento. El promedio General corresponde al promedio de la cinco cebollas de cada tratamiento.

  1. Agua mineral (% ± 2%)

  1. Agua corriente (% ± 2%)

757

860

775

855

710

760

845

852

900

990

Promedio General

(%± 2%)


798

863

Desvío Estándar

75

82

Fig. 2: Porcentaje de incremento de crecimiento de las raíces de A. cepa incubadas en agua mineral “Control” (1) y Agua corriente (2)

Tal como se desprende de la observación de la Fig. 2 las barras de error se superponen por lo cual no existirían diferencias significativas en el crecimiento de raíces de A. cepa incubada en agua mineral (control) y agua corriente proveniente de la red de agua potable de la ciudad de Pilar (Buenos Aires). La aplicación del T- Student con un valor de α = 0,05 fue P (T<=t) dos colas fue P˂ 0,05 por lo que se verifica estadísticamente la presunción anterior.

Índices mitóticos: El índice mitótico de las células incubadas en agua mineral osciló entre el 24 y 36% de las células observadas, mientras que las incubadas en agua corriente fueron algo superiores encontrándose índices de 36 a 44% a (Tabla 3, Fig. 3). Las observaciones en la morfología celular no mostraron diferencias respecto del formato células, posición de los núcleos, aparición de micronúcleos o nucléolos numerosos. La morfología celular fue similar en ambos casos (Fig 4). Tal como se observa en la Tabla y Fig 3, los índices mitóticos muestran diferencias significativas ya que sus barras de error no se superponen, en este caso no fue posible comparar los datos con un t- Student dado que el número de raíces investigados fue menor a ocho. Las diferencias encontradas indicarían que existirían un mayor número de células en mitosis en las raíces de las cebollas incubadas con el agua corriente de red.

Tabla 3: Número de células en mitosis e índices mitóticos en la raíces de Acepa incubadas en agua mineral (control) y agua corriente proveniente de la red de agua potable de la ciudad de Pilar. (El índice mitótico fue calculado de acuerdo con la ecuación 2)

NÚMERO DE CÉLULAS EN MITOSIS (CEL±1CEL)

PROM(CEL±1CEL)

± SD

TRATAMIENTOS

R1

R2

R3

R4

R5

7±1

AGUA MINERAL

6

8

7

6

9

AGUA CORRIENTE

10

11

9

11

10

10±1

TRATAMIENTOS

INDICE MITÓTICO (%±1%)


PROM (%±1%)

± SD

AGUA MINERAL

24

32

28

24

36

29±5

AGUA CORRIENTE

40

44

36

44

40

40±3

Fig. 3: Índices mitóticos calculados para las raíces de A. cepa incubadas en agua mineral (control) y agua corriente extraída de la red de agua potable de la ciudad de Pilar

En las tabla 4 se presentan los datos brutos observados en el conteo de células en cada fase mitótica a fin de poder calcular el índice mitótico de cada fase (Tabla 5, Fig. 4).

Tabla 4: Número de células observadas en cada fase de mitosis. El número de observaciones es el número de réplicas, en cada caso se contaron 25 células por cada réplica.

FASE

N° DE OBSERV.

INTERFASE (CEL±1CEL)

PROFASE

(CEL±1CEL)

METAFASE (CEL±1CEL)

ANAFASE (CEL±1CEL)

TELOFASE (CEL±1CEL)



1

19

3

2

0

2



2

20

2

1

1

1

AGUA MIN

3

18

1

2

3

1

 

4

18

2

1

0

4

 

5

20

2

1

0

2

PROMEDIO

(CEL±1CEL)




19

2

1

1

2

SD (CEL±1CEL)




1

1

1

1

1

FASE

N° DE OBSERV.

INTERFASE

(CEL±1CEL)

PROFASE

(CEL±1CEL)

METAFASE (CEL±1CEL)

ANAFASE (CEL±1CEL)

TELOFASE

(CEL±1CEL)



1

13

3

2

4

3




2

15

4

3

2

1

AGUA RED

3

14

3

3

3

2




4

16

1

3

3

2




5

17

1

2

2

3

PROMEDIO




15

2

3

3

2

SD




2

1

1

1

1


Tabla 5: Tabla de datos procesados del Porcentaje de células de la raíz de A. cepa en cada fase de la mitosis correspondiente a las cebollas incubadas en agua mineral (AGUA MIN) y agua de red. Se coloca entre paréntesis el porcentaje y su error para cada réplica.

INDICE DE CADA FASE (%±1%)

N° OBSERV.

PROFASE (%±1%)

METAFASE (%±1%)

ANAFASE (%±1%)

TELOFASE (%±1%)




1

43

29

0

29




2

40

20

25

20

AGUA MIN

3

14

29

33

14




4

29

14

0

57




5

40

20

0

40

PROMEDIO (%±1%)




33

22

12

32

SD (%±1%)




12

6

16

17



















INDICE DE CADA FASE

(%±1%)

N° OBSERV

PROFASE (%±1%)

METAFASE (%±1%)

ANAFASE (%±1%)

TELOFASE (%±1%)




1

25

17

33

25




2

40

30

20

10

AGUA RED

3

27

27

27

18




4

11

33

33

22




5

13

25

25

38

PROMEDIO (%±1%)




23

26

28

23

SD (%±1%) (%±1%)




12

6

6

10

Tal como se observa en la Fig. 5 la dispersión fue muy alta en ambas observaciones, sin embargo se encuentra mayor dispersión en las células de A. cepa incubadas con agua de red. Asimismo en posible ver a partir de la superposición de las barras de error que sólo existen diferencias significativas en anafase, observándose un menor porcentaje de células en esta fase en las raíces de A.cepa incubadas con agua de red..

Fig. 4: Porcentaje de células de la raíces de A. cepa observadas en cada fase de la mitosis al ser incubadas con agua de red y agua mineral. Se presentan las barras de error para cada observación. Las barras representan el promedio de cinco réplicas en cada caso



DISCUSIÓN Y EVALUACIÓN

Bibliografía

  • IANNACONE O., José  y  ALVARINO F., Lorena. Ecotoxicological Effects of Three Heavy Metals on the Root Growth of Four Vascular Plants. Agric. Téc. [online]. 2005, vol.65, n.2 [citado  2014-12-10], pp. 198-20.

Disponible en:

. ISSN 0365-2807.  http://dx.doi.org/10.4067/S0365-28072005000200009.

  • TORRES RODRIGUEZ, Marina Teresa. Empleo de los ensayos con plantas en el control de contaminantes tóxicos ambientales. Rev Cubana Hig Epidemiol [online]. 2003, vol.41, n.2-3 [citado  2014-12-10], pp. 0-0.

Disponible en:

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1561-30032003000200009&lng=es&nrm=iso>. ISSN 1561-3003.

  • http://www.pilar.com.ar/index.php?option=com_content&view=article&catid=75:agua-potable-en-pilar&id=104:pilar-y-el-agua-potable-&Itemid=63- Visitado el 18/12/2014.

  • http://www.pilardetodos.com.ar/20100522/aguanota.html- Visitado el 18/12/2014



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  • SIDALIN, CCH Plantel Oriente-Evaluación genotoxicológica de dos muestras de agua usando Allium test- Cuidad de Mexico, 2012.



  • ANDRIOLI, N.; WULFF, A.; MUDRY, M. Allium cepa como biomonitor de toxicidad y genotoxicidad de metronidazol. Theoría, 2006, vol. 15, p. 9-16p.





  • FREYRE, S., ESTRADA, M., BOLAÑOS, H. 2009. Estudio preliminar de citotoxicidad y genotoxicidad de un extracto de origen vegetal conocido como palmo rosado en células meristemáticas de Allium cepa.Memorias, 5: 12-17.

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