Titulo: Análisis clínico e inmunológico de la Leishmaniasis Cutánea antes y después de diversos tratamientos






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títuloTitulo: Análisis clínico e inmunológico de la Leishmaniasis Cutánea antes y después de diversos tratamientos
fecha de publicación27.09.2015
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Titulo: Análisis clínico e inmunológico de la Leishmaniasis Cutánea antes y después de diversos tratamientos.

Autores: José A. O’Daly1,2, Humberto M. Spinetti2 ,Joe Gleason1, María B. Rodríguez2

1Astralis LTD, 1076 Stuyvesant Ave, Irvington, New Jersey 07111, USA email:joseodaly@aol.com

2Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), Altos de Pipe, Km. 10 Carretera Panamericana, Caracas 1010A, Venezuela
Amastigotes de L(L)amazonensis(La); L(L)venezuelensis(Lv); L(V)brasiliensis(Lb) y L(L)chagasi(Lch) se cultivaron en un medio de cultivo libre de células (Medio O’Daly) donde proliferan como parásitos intracelulares [1]. Un ensayo clínico en 87 pacientes de una región hiperendemica de leishmaniasis cutánea (CL), prevalencia 24.8 o/oo, en Guatire, Estado Miranda, Venezuela, desde Enero 1994 hasta Agosto 2000, mostro lesiones localizadas en áreas descubiertas del cuerpo con tiempo de remisión diferentes con distintos tratamientos (Tabla 1).

Tabla 1: Lesiones en pacientes con infección primaria y su tratamiento

Localización de 170 lesiones, n=lesiones, n/170 = (%)

Pierna derecha

Pierna izquierda

Brazo derecho

Brazo izquierdo

Abdomen

Tórax

Cabeza

69(40.58)

43(25.29)

22(12.94)

15(8.82)

6(3.52)

7(4.11)

8(4.70)

Tratamientos en 87 pacientes con lesiones primarias n=pacientes, n/87 = (%)

Tratamientos

Dosis

Remisión

Remisión semanas

REa 31, (35.63)

ninguna

(100%)

7.41±2.71

Glub 37,(42.52)

24.54±15.07

35/37, (94.59 %)

9.02±5.04

VTc 19, (21.83)

6.36±3.41

(100%)

7.40±2.70

a RE: Remisión espontanea. b Glu: Meglumina antimoniato o Glucantime®. cVT: Leishmania amastigotes (La, Lv, Lb, Lch) post tratamiento con TLCK y extracción con NP-40.

La reacción intradérmica (RID) con leishmanina polivalente VT como prueba de sensibilidad retardada, considerada positiva con un diámetro >5mm, fue mayor en pacientes con LC activa en infecciones secundarias, y significativamente diferente a los pacientes con infección activa primaria (p<0.001) mientras que en pacientes post-remisión clínica los valores fueron similares (p=0.96) pues ya los pacientes estaban sensibilizados a los antígenos leishmanicos. En 127 controles sanos encontramos 22.04% de positividad (Tabla 2). Tabla 2: Reacción intradérmica (RID) con leishmanina polivalente en pacientes con leishmaniasis cutánea activa, post-remisión clínica espontanea de las lesiones y en controles sanos.

RIDa en mm Promedio ± desviación estándar (pacientes)

Activa

Post-remisión clínica

Controles Sanos

infección primaria (45)

infección secundaria (20)

infección primaria (60)

infección secundaria (13)

RID-(99)

RID+(28)

9.70±0.66

15.60±0.72

14.68±0.99

14.76±0.06

0.12±0.69

10.4±4.98

a El punto de corte para considerar una RID positive fue > 5 mm.
Los voluntarios vacunados RID- mostraron mayor diámetro post-VT (p<0.001), mientras que la RID fue similar (p=1.0) en voluntarios RID+ antes y después de VT. Los controles no vacunados mostraron una mayor RID en voluntarios con RID+ (p<0/001) (Tabla 3), con un 22% de positividad similar a otros análisis en Brasil, Ecuador, Perú y la región andina [2,3,4].


Tabla 3: Reacción de hipersensibilidad retardada en voluntarios con reacción intradérmica positiva y negativa en vacunados con VT y en controles sanos no vacunados

RIDa en mm leishmanina polivalente promedio ± desviación estándar (pacientes)

Controles no vacunados

Vacunados VTb

RID- (69)

RID+ (18)

RID- (61)

RID+ (10)







Pre-VT

Post-VT

Pre-VT

Post-VT

0.07±0.58

10.41±5.35

0.18±0.8

9.03±3.33

10.38±4.53

13.95±6.42

a El punto de corte para considerar una RID positiva fue > 5 mm.

La mayoría de los casos se encontraron en controles RID- de los cuales el 26% tuvo RE y el 73% recibió Glucantime® En voluntarios RID- post-VT se encontraron 9 casos 4 con RE 5 recibieron Glu. En 10 pacientes RID+ post VT se encontraron 3 casos solo 1 recibió Glu los demás RE. Todos los pacientes tuvieron seguimiento de 6 años (Tabla 4).

Tabla 4: Incidencia de leishmaniasis cutánea con RID- y RID+ en voluntarios no vacunados y vacunados con VT

Casos de leishmaniasis cutánea localizada y su tratamiento n= pacientes, (%)




Controles no-vacunados

Voluntarios vacunados




RID-

RID+

RID- Post-VTc

RID+ Post-VT




41/69 (59.42)

5/18 (27.7)

9/61 (14.75)

3/10 (30)

RSa

11/41 (26.8)

4/5 (80)

4/9 (44.4)

2/3 (66.7)

Glub

30/41 (73.2)

1/5 (20)

5/9 (55.6)

1/3 (33.3)


a RE: Remisión espontanea. b Glu: Meglumina antimoniato o Glucantime®. cVT: Leishmania amastigotes (La, Lv, Lb, Lch) post tratamiento con TLCK y extracción con NP-40.

Los anticuerpos caracterizados por ELISA (“Enzyme Linked Immunosorbent Assay”) disminuyeron en el suero post remisión clínica de las lesiones comparado con la infección activa (p<0.001) con un valor diagnostico de 1.50 a 1.84 para las 4 especies de Leishmania (Fig 1).

Figura 1: ELISA con antígenos monovalentes suero de pacientes con LC activa y post-remisión de las lesiones comparados con controles sanos. Error estándar del promedio menor a 5% no mostrado en el grafico.

Los valores entre pre-RE y pre-VT fueron similares (p>0.05) y mayores a los post-remisión. Los valores post-RE, post-VT y post-Glu fueron similares y menores que en la infección activa confirmando la efectividad de VT y Glu para el tratamiento de la LC. Los valores post Glu en pacientes sin remisión fueron mayores a los pacientes con remisión lo cual confirma la ELISA como instrumento útil para seguir la infección en LC (Fig 2) la cual debe disminuir al remitir las lesiones.
Figure 2: ELISA con antígenos monovalentes suero de pacientes con LC activa en infección primaria, antes de RE o VT y post-remisión de las lesiones post RE, Glu o VT comparados con pacientes que no remitieron con Glu. Error estándar del promedio menor a 5% no mostrado en el grafico (Pacientes).

La: L(L)amazonensis ; Lv: L(L)venezuelensis,; Lb: L(V)brasiliensi,; Lch: L(L)chagasi.

bRE: Remision Espontanea. cVT: Proteinas de amastigotes de Leishmania post TLCK y NP-40. dGlu: Meglumina antimoniato o Glucantime®.

La frecuencia de bandas antigénicas y el área de la densidad óptica integral en la densitometria de los immunoblottings disminuyeron significativamente con los sueros de RS, y después del tratamiento de los voluntarios infectados con Glu o VT, lo cual explica la disminución en la DO de los valores en ELISA por disminución de los anticuerpos, debido a represión de MHCH I y II en células infectadas[5,6] inhibicion en la presentación de antígenos por MHC II [7] secuestro de MHC II en el fagolisosoma [8]

Table 5: Amastigotes antigens in immunoblottings, revealed by 80-100% sera,

from patients with active CL, after clinical remission, and healthy controls.

Antígenos (kDa) revelados con sueros de pacientes con LC y de controles (pacientes)a

ACTIVAS(10)

REMISION(10)

CONTROLES IDR- (7)

La

Lb

Lv

Lch

La

Lb

Lv

Lch

La

Lb

Lv

Lch

22

17

22

35

22

22

33

33

17

17

29

33

33

22

33

40

33

35

35

50

33

29

33

45

35

29

35

50

35

40

50

65

45

33

45

50

40

33

40

57

40

50

74

74

50

45

50

57

50

35

50

74

50

65

80

86

57

50

65

65

57

40

65

80

57

74

90

90

65

65

74

74

65

50

74

86

65

98

98

98

86

90

86

86

74

57

80

90

74

104




104

90

96

90

98

80

65




98

100

108







98

128

98




98

74




104













128

132







100

80




128

























104

86































128

90































132

98


































100


































104


































115































Numero Total de antígenos en immunoblottings

La

Lb

Lv

Lch

La

Lb

Lv

Lch

La

Lb

Lv

Lch

Lesiones Activas

Remisión clínica

Controles sanos

14

17

8

11

9

9

7

8

10

10

9

8



En números rojos pesos moleculares (PM) de bandas comunes en grupos con LC activa, en remisión o en controles. En números azules PM de bandas presentes en grupos activos y en remisión en el mismo paciente no presentes en controles. En números verdes antígenos específicos encontrados en una sola especie de Leishmania en grupos activos o en remisión.

Cada especie de Leishmania tiene un grupo específico de antígenos evidenciado por la sensibilización de clones de células B por antígenos de amastigotes no presentes en sueros de controles. El parasitismo intracelular se debe a los anticuerpos normales en el suero de los voluntarios que reconocen a los antígenos del parasito inmediatamente después de ser inoculados por el vector. La vacuna VT induce fundamentalmente inmunidad celular tanto en la remisión de las lesiones como en la protección contra la infección en LC, contrario al dogma que afirma que solo anticuerpos controlan la infección por virus, bacterias o parásitos.

Conclusiones

Antígenos de amastigotes de 4 especies de Leishmanias cultivadas en medio líquido libre de células [1] tratados con TLCK [9] indujeron remisión de la LC con 6 dosis de 500 µg/dosis intramuscular en 7 semanas y protegieron a los voluntarios de la LC en 6 años de seguimiento. La inmunidad humoral disminuyó después der la remisión de las lesiones demostrado por ELISA, frecuencia de bandas antigénicas y densidad del área densitometrica en immunoblottings. El parasitismo intracelular se debe al reconocimiento de los antígenos del parasito por anticuerpos normales post inoculación por el vector. La vacuna VT induce fundamentalmente inmunidad celular post-remisión de las lesiones. No se encontraron recaídas en pacientes vacunados con VT después de la infección primaria en 6 años de seguimiento. La vacuna VT también induce remisión clínica de la psoriasis [10,11], Artritis psoriatica [12], y artritis inducida por colágeno en ratones [13] Artritis reumatoide [14], e inhibe la proliferación de linfoma de células T in vitro [14,15] lo cual abre la aplicación de este tratamiento a un espectro amplio de enfermedades.

Referencias

  1. O’Daly JA, Rodríguez MB. (1988) Differential growth requirement of several Leishmania spp in chemically defined culture media. Acta Trop 45: 109-126.

  2. Nunes VL, Dorval ME, Oshiro ET, Noguchi RC, Arao LB, et al. (1991) Epidemiologic study on tegumentary leishmaniasis in the municipality of Corguinho, Mato Grosso do Sul. Studies in the human population Rev Soc Bras Med Trop 28: 185-193.

  3. Davies CR, Llanos-Cuentas EA, Pyke SD, Dye C (1995) Cutaneous leishmaniasis in the Peruvian Andes: an epidemiological study of infection and immunity. Epidemiol Infect 114: 297-318.

  4. Armijos RX, Weigel MM, Izurieta R, Racines J, Zurita C, et al. (1997) The epidemiology of cutaneous leishmaniasis in subtropical Ecuador. Trop Med Int Health 2: 140-152.

  5. Reiner NE, Ng W, McMaster WR (1988) Kinetics of gamma interferon binding and induction of major histocompatibility complex class II mRNA in leishmania infected macrophages. Proc Natl Acad Sci USA 85: 4330-4334.

  6. Reiner NE, Ng W, McMaster WR (1987) Parasite-accessory cell-interactions in murine leishmaniasis. II. Leishmania donovani suppresses macrophage expression of Class-I and class-II major histocompatibility complex gene products. J Immunol 138: 1926-1932.

  7. Fruth U, Solioz N, Louis JA (1993) Leishmania major interferes with antigen presentation by infected macrophages. J Immunol 150: 1857–1864.

  8. Kima PE, Soong L, Chicharro C, Ruddle NH, & McMahon-Pratt D (1996) Leishmania infected macrophages sequester endogenously synthesized parasite antigens from presentation to CD4+ T cell. Eur J Immunol 26: 3163–3169.

  9. O’Daly JA, Cabrera Z (1986) Immunization of hamsters with TLCK-killed parasites induces protection against Leishmania infection. Acta Trop 43: 225-236.

  10. O’Daly JA, Lezama R, Rodríguez PJ, Silva E, Indriago NR, et al. (2009) Antigens from Leishmania amastigotes induced clinical remission of psoriasis. Arch Dermatol Res 301: 1-13.

  11. O’Daly JA, Lezama R, Gleason J (2009) Isolation of Leishmania amastigote protein fractions which induced lymphocyte stimulation and remission of psoriasis. Arch Dermatol Res 301: 411-427.

  12. O’Daly JA , Gleason J, Lezama R, Rodriguez PJ, Siva E , et al. (2011) Antigens from leishmania amastigotes inducing clinical remission of psoriatic arthritis. Arch Dermatol Res 303: 399-415.

  13. O’Daly JA, Gleason JP, Peña G, Colorado I (2010) Purified proteins from Leishmania amastigotes-induced delayed type hypersensitivity reactions and remission of collagen-induced arthritis in animal models. Arch Dermatol Res 302: 567-581.

  14. O’Daly JA (2012) Psoriasis a systemic disease beyond the skin, as evidenced by psoriatic arthritis and many comorbidities. Clinical remission with a Leishmania amastigotes vaccine, a serendipity finding. In O’Daly JA , Editor. Psoriasis a Systemic disease. InTech publishers, Croatia; pp 1-56.

  15. O’Daly JA (2011) Psoriatic Disease: A Systemic Pathology, Structured by Psoriasis, Psoriatic Arthritis and Comorbidities. J Clin Rheumatol Musculoskel Med 2: 1-11.

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