Pruebas bioquímicas para el estudio del Déficit de Glucosa -6p- deshidrogenasa






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Adscripción a Hematología Clínica Período 2011-2012 Artículo de Revisión Bibliográfica

Adscripción a Hematología Clínica Período 2011-2012


Pruebas bioquímicas para el estudio del Déficit de Glucosa -6P- Deshidrogenasa

Toledo, Natalia Carolina

RESUMEN: El eritrocito requiere de vías metabólicas alternativas para garantizar su supervivencia y el transporte de oxígeno. Una de estas vías es la ruta de las pentosas, que tiene como una de sus enzimas fundamentales a la Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), cuyo déficit, que deriva de una patología hereditaria ligada al cromosoma X, repercute en una anemia hemolítica, cuando se ven involucrados ciertos factores predisponentes como la exposición a agentes oxidantes ambientales, o bien a infecciones, entre otros.

Más allá de las manifestaciones clínicas propias de toda anemia hemolítica aguda, existen expresiones en el análisis de laboratorio que son característicos y contribuyen al diagnóstico de la patología, tantas veces pasada por alto debido a su frecuente autolimitación y remisión sin mediar tratamiento.


INTRODUCCIÓN

El eritrocito, desprovisto de núcleo y otras organelas, es incapaz de replicarse, sintetizar proteínas y realizar fosforilación oxidativa. Necesita preservar los grupos sulfhidrilos de numerosas proteínas y prevenir el daño oxidativo, para garantizar una supervivencia aproximada de 120 días y cumplir con su función principal de transporte de oxígeno. Para tal fin emplea diferentes vías metabólicas; entre ellas, la vía de las pentosas[01].

La glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) interviene en la primera reacción de la ruta de las pentosas, catalizando la conversión de glucosa 6-fosfato (G6P) proveniente de la glucólisis anaerobia en 6-fosfogluconato (6PG) y obteniendo NADPH a partir de la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP). Esta vía es la principal fuente de obtención de la forma reducida del NADP en los eritrocitos humanos.
DEFICIENCIA DE GLUCOSA-6-FOSFATO DESHIDROGENASA ERITROCITARIA
Esta deficiencia constituye un desorden hereditario ligado al cromosoma X, en el cual la disminución de la actividad de la enzima resulta en una anemia hemolítica. Es la enzimopatía más común en el ser humano y el quinto defecto congénito más común a nivel mundial [13].

El déficit de esta enzima es un error latente, que no se expresa a menos que se produzcan determinadas alteraciones en el ambiente, generalmente la ingestión de ciertas sustancias o infecciones que hacen que se manifieste la existencia del defecto enzimático[02].

Se expresa por completo en los varones, y las mujeres heterocigotas son aparentemente normales. En estas últimas la actividad enzimática media de la G6PD puede ser normal, moderadamente reducida o muy deficiente, según la distribución de la población celular.
Mecanismo de hemólisis
La deficiencia de G6PD produce un fallo en el metabolismo del glutatión reducido (GSH) y el resultado de esto es la hemólisis. Como un elevado número de variantes deficientes de G6PD no se asocian a hemólisis crónicas, se evidencia que una pequeña cantidad de actividad residual es suficiente para los requerimientos del eritrocito. En las variantes deficientes de G6PD con hemólisis crónicas asociadas, la producción de NADPH es inadecuada, aunque se desconoce con exactitud como esto ocasiona la hemólisis. Una explicación razonable es que en estos casos los niveles de GSH son tan bajos que los grupos sulfhidrilos críticos en algunas proteínas claves no pueden ser mantenidos en su forma reducida y se producen uniones intramoleculares e intermoleculares entre estos grupos.

Se han demostrado con exactitud los pasos siguientes:

1. Algunos de los agentes que causan hemólisis estimulan la vía de las pentosas, esto indica que, en su presencia se requiere de un incremento en la producción de NADPH.

2. Una caída de los niveles de GSH se asocia a episodios hemolíticos en individuos deficientes de G6PD. En algunos casos, particularmente en el favismo, la hemólisis aguda se asocia con la formación masiva de cuerpos de Heinz y su presencia sirve de mediador en la destrucción de los glóbulos rojos.

4. Los radicales de oxígeno generados por la autooxidación de la hemoglobina también contribuyen a la formación de cuerpos de Heinz, proteólisis intracelular y peroxidación de los lípidos de la membrana.

La deficiencia de G6PD resulta de un fallo en el glóbulo rojo, cuando este es estimulado a incrementar la producción de NADPH necesario para la eliminación del peróxido de hidrogeno y los radicales libres del oxígeno, por lo que se ha denominado hemólisis oxidativa.
Manifestaciones clínicas
Anemia hemolítica congénita no esferocítica (AHCNE)
Luego del nacimiento, los síntomas de AHCNE pueden aparecer inmediatamente. El recién nacido es anémico y presenta íctero. En ocasiones la concentración de hemoglobina es normal y la hemólisis está compensada, pero el estrés oxidativo producido por el déficit en la producción de NADPH, puede desencadenar una drástica caída de los niveles de hemoglobina.

Frecuentemente una infección aguda o la administración de una droga oxidante desata los episodios de hemólisis.
Ictericia neonatal
Ha sido reportado que la ictericia en los recién nacidos, está asociada con la deficiencia de la G6PD. Muchos de los reportes provienen de la región mediterránea, aunque de manera esporádica, han sido reportados casos en otras partes del mundo.

Generalmente, la variante enzimática de G6PD encontrada en estos infantes es del tipo B- (variante deficiente con actividad enzimática muy disminuida), lo que implica una relación directa con la presencia de un estrés oxidativo, provocado por una disminución en la defensa antioxidante del eritrocito.
Favismo
Se denomina favismo a la hemólisis aguda que se desarrolla en algunos individuos después de la ingestión de los frijoles fava (Vicia faba) o la inhalación del polen de estos frijoles. Desde hace muchos años se ha establecido que existe una relación directa con la deficiencia de G6PD y se puede aseverar que todo individuo que presenta favismo es deficiente de G6PD, pero no todos los deficientes presentan hemólisis por la ingestión de este alimento. Los síntomas del favismo se desarrollan pocas horas después de la ingestión. Los más comunes son las náuseas, vómitos, malestar y vértigo. A estos síntomas les sigue una hemólisis aguda donde, a menudo, el conteo de eritrocitos cae por debajo de 1,0 x 10 12/L. En la mayoría de los glóbulos rojos son vistos cuerpos de Heinz.

Están presentes la hemoglobinemia y la hemoglobinuria. Los síntomas generalmente cesan luego de 2 a 6 días.

La fisiopatología de la hemólisis ha sido bien estudiada, el glóbulo rojo sufre un daño oxidativo producido por un agente químico y entre los que se han identificado están: pirimidina, aglicón, divicina e isouramil en combinación con el ácido ascórbico.
Anemia hemolítica inducida por infecciones
La severidad del proceso hemolítico está igualmente influenciada por un número de factores, entre estos la administración de drogas oxidantes, cifra inicial de hemoglobina, función hepática y la edad. Muchas infecciones por bacterias y virus son mencionadas como desencadenantes; particularmente importante son la hepatitis tipo viral, la neumonía y la fiebre tifoidea.

La generación de peróxido de hidrógeno por los neutrófilos polimorfonucleares puede provocar una disminución en la cantidad de glutatión reducido, por lo que disminuye la capacidad protectora de la célula. Por otra parte, la activación de los neutrófilos interviene directamente en la peroxidación de los lípidos de la membrana y provoca de forma directa la destrucción de la célula. Ambos mecanismos influyen en la destrucción de los eritrocitos, pero posiblemente no son los únicos.
Anemia hemolítica inducida por fármacos
La aparición de episodios hemolíticos después de la ingestión de ciertas drogas tuvo su origen en individuos de la raza negra que recibieron primaquina. Posteriormente se descubrieron muchas drogas con efecto similar, constituyendo la anemia hemolítica aguda inducida por fármacos el prototipo clínico de la deficiencia de G6PD. Los episodios típicos de hemólisis se producen de 1 a 3 días después de la administración del fármaco. Hay una rápida caída de los valores del hematocrito y de la hemoglobina (Hb), y la orina se torna oscura. Generalmente con una duración de 4 a 6 días la hemólisis cesa, y se presenta una reticulocitosis, seguida por un ascenso del hematocrito y de la Hb.
LABORATORIO EN EL DÉFICIT DE G6PD
Laboratorio general [06]
El paciente puede experimentar una crisis hemolítica aguda horas después de exponerse a un estrés oxidante. En casos graves, pueden aparecer hemoglobinuria y colapso vascular periférico. Como la población formada por los hematíes más viejos es la única que se destruye rápidamente, la crisis hemolítica tiende a cesar espontáneamente, aunque continúe la exposición al oxidante. En casos de déficit moderado, la masa eritrocitaria desciende un 25 a 30 % como máximo. Durante la fase aguda de la hemólisis, el descenso brusco del hematocrito se acompaña de elevación plasmática de la hemoglobina y la bilirrubina no conjugada, junto con un descenso de la haptoglobina del plasma (características de cualquier hemólisis intravascular). La oxidación de la hemoglobina da lugar a la formación de cuerpos de Heinz, que se descubren en la tinción supravital [07], como la del violeta de genciana. Sin embargo, no suelen verse cuerpos de Heinz pasado un día aproximadamente, pues esas inclusiones son eliminadas enseguida por el bazo. Esta eliminación da lugar a la formación de «hematíes mordidos», es decir, eritrocitos que han perdido una parte periférica de la célula. Varias mordidas acaban produciendo fragmentos de hematíes. Los individuos con una enzima más inestable (forma mediterránea) presentan una actividad enzimática mucho menor en general que los individuos con otras variedades. Como consecuencia de ello, las manifestaciones clínicas son más severas[04].
Diagnóstico de laboratorio
El diagnóstico del déficit de G6PD se realiza por medio de un análisis espectrofotométrico cuantitativo, o más comúnmente, por un test rápido de mancha fluorescente que detecta la generación de NADPH a partir de NADP. El test es positivo para déficit de G6PD si la mancha de sangre no fluoresce bajo la luz UV [05].

Pruebas basadas en la reacción de cadena de polimerasa son capaces de detectar mutaciones específicas y son usadas en screenings poblacionales, estudios familiares o en el diagnóstico prenatal.

En pacientes con hemólisis aguda, el testeo del déficit de G6PD puede arrojar falsos negativos, ya que los eritrocitos viejos con un alto porcentaje de deficiencia enzimática son los primeros en ser destruidos. Los eritrocitos jóvenes y reticulocitos tienen una actividad enzimática normal o prácticamente normal [03].

Las mujeres heterocigotas son difíciles de diagnosticar por el mosaicismo del cromosoma X establece una sutil deficiencia que puede no ser detectada por los métodos de screening.
Otras pruebas de laboratorio
Test de reducción de la metahemoglobina (Brewer’s test) [09]
Esta prueba fue desarrollada por Brewer et al. y se fundamenta en la capacidad del nitrito de sodio de convertir la hemoglobina (Hb) a metahemoglobina (Hi). Cuando no se añade azul de metileno, la metahemoglobina persiste, pero la incubación de la muestra con azul de metileno permite la estimulación de la vía de las pentosas fosfato en sujetos con niveles normales de G6PD. En éstos últimos, la Hi se reduce durante el período de incubación. En sujetos con d{eficit de G6PD, el bloqueo en la vía de las pentosas fosfato impide esta reducción. La presencia de Hi o Hb se detecta mediante la evaluación del color de la mezcla de reactivos. En muestras de pacientes normales se produce un color rojo claro, sin embargo la sangre de los sujetos deficientes da un color marrón. Los heterocigotos dan reacciones intermedias.
Test de autohemólisis [11]
Esta prueba consiste en la medición del porcentaje de hemólisis espontánea que ocurre luego de la incubación de los eritrocitos del paciente en su propio suero durante 48 horas a 37°C, en condiciones estériles. Siempre se desarrollará la reacción en dos tubos, ya que en uno se añadirá además sacarosa, lo cual disminuye la hemólisis. Es una prueba orientada al screening de la esferocitosis hereditaria ya que en pacientes con dicha patología, la lisis de hematíes en ese período de tiempo será mayor. En el caso del déficit de G6PD, estudios demuestran que el porcentaje de autohemólisis se encuentra algo elevado con respecto al valor normal (2,9% contra 1,7% en pacientes normales) pero este incremento no resulta significativo (en la esferocitosis hereditaria el porcentaje alcanza el 10,1%), e inclusive en sujetos con anemia hemolítica crónica no esferocítica, el porcentaje de autohemólisis es normal [10].
Test de los Cuerpos de Heinz
Este test es útil como screening para individuos con déficit de G6PD, pero no es específico, ya que también puede dar positivo en casos de déficit de GSH, de GSH sintetasa, glutamil cisteín sintetasa y hemoglobinas inestables.

La sangre entera del paciente se trata con un buffer especial para luego ser incubada con cristal violeta. Este colorante tiñe los cuerpos de Heinz, que luego se evidenciaran en extendidos observados a 100X con objetivo de inmersión. Se cuentan aquellos eritrocitos con más de cinco cuerpos de Heinz sobre un total de 1000 hematíes contados, y se expresa este valor en porcentaje. En un individuo con déficit de G6PD en un episodio agudo de hemólisis se esperan valores superiores al 21%.
Cuerpos de Heinz. Imagen microscópica de un extendido de sangre periférica. (Directorio de imágenes médicas. Sociedad de Pediatría de Andalucía Oriental).
Estudio de movilidad electroforética
Sirve para analizar el tipo de variante de G6PD que presenta el paciente. En los años cincuenta y con ayuda principalmente de la electroforesis se pudieron identificar las principales variantes (mutaciones) de esta enzima. En la actualidad, la variante más común de G6PD en todo el mundo se denomina tipo B y se considera como la normal. En poblaciones de raza negra se encuentran dos variantes conocidas como A(+) y A (-) presentes en el 20% y 12% respectivamente. Ambas tienen igual movilidad electroforética pero A(-) es muy inestable y su cinética es diferente. De estas dos, la variante asociada a mayores anomalías es la G6PD A(-). Se encuentra principalmente en sujetos de raza negra del Africa Central [12].

Este test se basa en la detección de NADPH requerido para la conversión del colorante Tetrazolium a formasán insoluble. La aplicación exitosa de estos métodos requiere que la reacción avance en la dirección de la oxidación del sustrato con concomitante reducción de la coenzima y formación del NADPH. La principal ventaja de este método es su alta sensibilidad, y su desventaja es que la banda generada es rápidamente destruída por la luz y el oxígeno.

Corrida electroforética de G6PD [14].
Los patrones electroforéticos de G6PD son comparados con un control de G6PD B tipificado en Francia. En los casos deficientes o de portadoras, las bandas de las variantes rápidas corren 4 o 5 mm por delante del testigo B, por lo cual se las clasifica como variante rápida.
El déficit de G6PD constituye una patología latente que requiere ser tenida en cuenta al momento de presentación de episodios agudos de hemólisis cuando el individuo se ha expuesto a agentes oxidantes que desatan este cuadro.

La importancia recae en el diagnóstico diferencial apropiado con otras causas de anemia hemolítica y en este punto el laboratorio cobra particular relevancia ya que posee las herramientas suficientes para hacer dicha diferenciación, la cual no involucra, en su mayoría, métodos complejos, y aporta una gran información, ya que a pesar de no presentar tratamiento más que paliativo, esta patología amerita su conocimiento por parte del individuo que la padece para lograr así evitar el contacto con los agentes capaces de expresar la deficiencia enzimática en presente en él. Ω
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

[01] Bioq. Silvia Eandi Eberle, Bioq. Nerina García Rosolen, Bioq. Carolina Urtasun, Dra. Gabriela Sciuccati, Dra. Lilian Díaz, Bioq. Valeria Savietto, Dra. Andrea Candás, Dra. Vanesa Avalos Gómez, Dra. Carolina Cervio, Dra. Mariana Bonduel y Dra. Aurora Feliú Torres. 2011. Deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Serie de casos clínicos. Arch Argent Pediatr;109(4):354-361

[02]. Lic. Tatiana Acosta Sánchez, Dr. Daniel Pedro Núñez y Lic. Mayelin Suárez Luengo. 2003. Anemia hemolítica por deficiencia de G6PD y estrés Oxidativo. Rev Cubana Invest Biomed 22(3):186-91

[03] Jennifer E. Frank. 2005. Diagnosis and Management of G6PD Deficiency. American Family Physician Volume 72, Number 7.

[04] Fessites Castilla y León. 2007. Curso: Hemoglobinopatías y Talasemias. Diagnóstico por el Laboratorio. Comisión de Formación Continuada de las Profesiones Sanitarias.

[05] Wong F L, Boo N Y, Ainoon O, Wang M K. 2009. Comparison of detection of glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency using fluorescent spot test, enzyme assay and molecular method for prediction of severe neonatal hyperbilirubinaemia. Singapore Med J; 50 (1) : 62

[06] Crisp, René Leonor. 2010. Membranopatías: Diagnóstico de laboratorio. Hospital Nacional Prof. A. Posadas.

[07] Sherrie L. Perkins, MD, PhD. 2006. Anemia. Diagnosis of Anemia. Practical Diagnosis of Hematologic Disorders. American Society for Clinical Pathology.

[08] J Mial 1985. Laboratory medicine Hematology. Six edition The C.V. Mosby Company. San Louis, Toronto. London.


[09] R Sugathadasa , D M Dissanayake. 2010. The effect of different haemoglobins on the glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency screening test (Brewer’s test). Journal of diagnosis Pathology.

[10] Dr. Kamal E. Higgy. 2009. Hereditary Spherocytosis. Hereditary Haemolitic anemias.

[11] Carrasco Anabalón, Sergio Alberto. 2011. Anemia esferocítica y Resistencia Osmótica. Prueba de resistencia osmótica y autohemólisis. Universidad de Concepción, Facultad de Medicina.

[12] RUIZ Wilson, ULLOA Victor, BAILON Oscar. 2010. Prevalencia de la deficiencia de glucosa - 6 – fosfato deshidrogenasa en donadores voluntarios de sangre que acuden a los hospitales nacionales Cayetano Heredia y Arzobispo Loayza. Lima - Perú. Instituto de Investigaciones de la Altura. Hospital Nacional Cayetano Heredia.

[13] Ramírez-Cheyne, Julián; Zarante, Ignacio. 2009. Deficiencia de glucosa-6- fosfato deshidrogenasa: situación actual, su relación con malaria y estrategias para calcular su prevalencia. Universitás Médica, Vol. 50, num. 1, pp 58-76.

[14] Daniela Barbosa Nicolielo. 2004. Atividade da 6-fosfogliconato desidrogenase em deficientes de glicose-6-fosfato desidrogenase. Programa de Pós-Graduação em Análises Clínicas.



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