Resumen: Los sistemas de biorremediación consisten principalmente en el uso de los microorganismos naturales (levaduras, hongos o bacterias) existentes en el






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“Efecto de microorganismos presentes en aguas contaminadas como degradadores de residuos de petrotrÓleo”

8 de Diciembre de 2009


Efecto de microorganismos presentes en aguas contaminadas como degradadores de residuos de petróleo.”


Gómez Sánchez Jesús Emmanuel

Universidad Nacional Autónoma de México

Facultad de Estudios Superiores Iztacala

BIOLOGÍA, MÉTODO CIENTIFICO III

Reyes Iztacala, Av. de los Barrios # 1,Col . Los Reyes Iztacala, Tlalnepantla, Estado de México.


RESUMEN:

Los sistemas de biorremediación consisten principalmente en el uso de los microorganismos naturales (levaduras, hongos o bacterias) existentes en el medio para descomponer o degradar sustancias peligrosas en sustancias de carácter menos tóxico o bien inocuas para el medio ambiente y la salud humana. Las medidas biocorrectoras se llevan empleando en la descontaminación de suelos y aguas contaminadas por hidrocarburos desde hace décadas con importante éxito. Estas técnicas biológicas pueden ser de tipo aerobio (presencia de un medio oxidante), o bien de tipo anaerobio, (medio reductor) a través de la activación de genes regulados (operones). En el presente trabajo se determino la eficiencia de microorganismos extraídos de diferentes lugares de aguas contaminadas con la finalidad de observar si existe una capacidad degradadora de n-alcanos, teniendo éxito en dos de las muestras obtenidas. En este estudio también se desarrollo un método fácil para identificar la cantidad de n-alcano degradada siendo esta proporcional al crecimiento de las cepas.
Palabras claves: Biodegradación, genes regulados, n-alcanos
ABSTRACT:

Bioremediation systems consist mainly of the use of naturally occurring microorganisms (yeast, fungi or bacteria) exist in the middle to break down or degrade hazardous substances into less toxic substances or nature-friendly environment and human health. Biocorrectoras measures are being employed for the decontamination of soils and water contaminated by hydrocarbons for decades with significant success. These biological techniques can be either aerobic (presence of oxidizing half) or type anaerobic (reducing environment) through the activation of regulated genes (operons). This study determines the efficiency of microorganisms extracted from different parts of polluted water in order to see whether there is degrading abilities of n-alkanes, having success in two of the samples obtained. In this study also developed an easy method to identify the amount of n-alkane degraded being this proportional to the growth of the strains.
Keywords: Biodegradation, regulated genes, n-alkanes




INTRODUCCIÓN:

Los hidrocarburos son un tipo de contaminantes que afectan a la calidad del agua de manera importante. En la actualidad los derrames de petróleo, cada día son más frecuentes en los océanos, dejan estelas de contaminación de efectos a muy largo plazo. La formación de una película impermeable sobre el agua en las zonas de derrame afecta rápida y directamente a las aves y a los mamíferos acuáticos ya que obstruye el intercambio gaseoso y desvía los rayos luminosos que aprovecha el fitoplancton para llevar a cabo el proceso de fotosíntesis.

Aproximadamente el 50% del petróleo que llega a los mares es arrastrado por corrientes fluviales.

Los hidrocarburos derramados en el mar se evaporan o son degradados en un proceso muy lento por bacterias, las cuales dependen de factores como los nutrientes presentes, el estado físico de los hidrocarburos, el oxigeno, temperatura (en aguas calientes y mucho más lento en aguas frías), salinidad y presión, que influyen en la biorremediación del petróleo.

En las aguas calientes se evapora a la atmósfera la mayor parte de este tipo de hidrocarburos en uno o dos días, y en aguas frías este proceso puede tardar hasta una semana. Otro tipo de sustancias químicas permanecen en el agua superficial y forman burbujas de alquitrán o musgo flotante. Estos residuos, también, cubre las plumas de las aves, especialmente de las que se zambullen, y la piel de mamíferos marinos, destruyendo el aislamiento térmico natural de los animales y también afecta su capacidad para flotar, por lo cual mueren de frío o porque se hunden y ahogan. Los componentes pesados del petróleo se hunden hasta el fondo del mar y pueden matar organismos que habitan en las profundidades como los cangrejos, ostras, mejillones y almejas. Además los que quedan vivos no son adecuados para su consumo.

La mayoría de los ecosistemas marinos expuestos a grandes cantidades de petróleo crudo requieren unos 3 años para su recuperación. Sin embargo, los ecosistemas marinos contaminados por petróleo refinado, en especial en los estuarios, requieren de 10 años o más para su recuperación.

La manera tradicional de extraer o recuperar el petróleo es mediante bombeo con agua lo cual representa una pérdida considerable de agua.

Una alternativa para la degradación de hidrocarburos es la utilización de un sistema de microorganismos capaces de utilizar los hidrocarburos como fuente de energía (Bossert y Bartha, 1984).

Existen numerosas bacterias capaces de crecer sobre alcanos gaseosos y líquidos (Ratajczak et,al., 1998).

Se ha demostrado el uso de n-alcanos por Acinetobacter sp, Pseudomonas, Bacilos megaterium, Rhodococcus sp, como bacterias capaces de degradar residuos de petróleo.

El empleo de microorganismos naturales existentes en el medio para descomponer o degradar sustancias peligrosas es conocido como biorremediación.

El fundamento bioquímico de la biorremediación se basa en que en la cadena respiratoria, o transportadora de electrones de las células, se van a producir una serie de reacciones de óxido-reducción cuyo fin es la obtención de energía. La cadena la inicia un sustrato orgánico (compuestos hidrocarburados) que es externo a la célula y que actúa como dador de electrones, de modo que la actividad metabólica de la célula acaba degradando y consumiendo dicha sustancia. Los aceptores más comúnmente utilizados por los microorganismos son el oxígeno, los nitratos, el hierro (III), los sulfatos y el dióxido de carbono. Cuando el oxígeno es utilizado como aceptor de electrones la respiración microbiana se produce en condiciones aerobias, y los procesos de biodegradación serán de tipo aerobio; sin embargo, si utiliza los sulfatos o el dióxido de carbono se produce en condiciones reductoras o anaerobias, y los procesos de biodegradación serán de tipo anaerobio.(Maroto y Rogel, 2002)

El uso de tecnologías de biorremediación para el tratamiento de sitios contaminados es una opción que presenta ventajas con respecto a métodos físicos y químicos: son sencillas de implementar; efectivos y ambientalmente seguros; los contaminantes se destruyen o transforman; generalmente no se requieren tratamientos adicionales (80 - 150 USD/m3). (Volke y Velasco, 2003). A demás se ha demostrado que el empleo de microorganismos autóctonos ha tiene un mejor éxito en la biorremediación que los microorganismos de laboratorios (Van Hamme, et.al. 2003). Por lo que la búsqueda y empleo de cepas autóctonas capaces de degradar n-alcanos es una buen estrategia para el tratamiento de aguas contaminadas

OBJETIVO:


  • Obtener microorganismos capaces de crecer en condiciones ambientales que puedan facilitar la eliminación de contaminantes, y degradar hidrocarburos, utilizándolos como fuente carbono y energía.


MÉTODO:


  • Cultivo de microorganismos:

Se obtuvieron tres muestras de aguas contaminadas de los lugares de M1 (Rio de los remedios, Edo. de México), M2 (Parque Bosques de Aragón, Edo. de México), M3 (Rio Ondo, Edo. de México) la Pseudónima aeruginosa fue donada por el centro de investigación UBIPRO.

Posteriormente en tubos de ensayo previamente estériles se coloco 9.95ml de la cada uno de las muestras recolectadas y a cada uno se le suministro como única fuente de carbono y energía .05ml de petróleo.

Como control positivo se utilizó un cultivo de Pseudónima aeruginosa por su capacidad ya conocida para la degradación de n-alcanos, en el medio mínimo M9 con 1% de petróleo, el cual se preparo con (g/L): 6 de Na2HPO4, 3 de KH2PO4, .5 de NaCl, 2 de NH4Cl. Se eterizó a 121º C, durante 15min. La cantidad de bacterias presentes fue de 3 X 108, utilizando el método Brad Fort.

Pare tener un número similar de bacterias en nuestro control y las muestras obtenidas, se diluyó la concentración del control positivo a 3 x 106

Como control negativo solamente se empleo el medio mínimo sin ningún microorganismo presente.

Se realizaron tres repeticiones por cada cultivo.


  • Cuantificación de microorganismos:


Para la cuantificación de los microorganismos presente en las diferentes muestras obtenidas se utilizo el conteo por la cámara de Neubauer (Método 1), después de colocar la muestra, se cuenta el número de células de los 4 cuadros grandes colocados en las esquinas y se calcula (número total de células contadas x 2500 x el factor de dilución) (Aguilar, et, al 2008)

Tres repeticiones por muestra.

La cuantificación se realizo durante tres semanas, cada 8 días obteniendo como resultado tres cuantificaciones de cada muestra, esperando el crecimiento máximo de los microorganismos en este tiempo.


  • Cromatografía por capa fina:


En la identificación de los compuestos presentes en el petróleo utilizado y su degradación en las distintas muestras se empleo una cromatografía de capa fina.

Primero se selecciono el solvente que en este caso fue benceno, con la finalidad de extraer el mayor porcentaje de alcanos, considerando sus características químicas. Como fase estacionaria se utilizo una placa de silica con indicador de fluorescencia.

La cromatografía se rebeló con la utilización luz UV con longitud de onda larga y corta.



RESULTADOS:


  • Crecimiento de los microorganismos:


Cuadro 1:

muestra

Células por mililitro

M1

3050000

M2

7400000

M3

2450000

C+

30000000

C-

0


Este cuadro muestra el número de células existentes en los medios por mililitro, al inicio del experimento.

Cuadro 2:



muestra

Semana 1

Semana 2

Semana 3

M1

1800000

862500

112500

M2

575000

162500

20000

M3

1625000

387500

65000

C+

3000000

242500

187500

C-

0

0

0



En el cuadro se representa el crecimiento de los microorganismos existentes en los tratamientos (M1, M2, M3) en un lapso de tiempo de tres semanas y como única fuente de energía y carbono .5ml de petróleo

Grafica 1:


En esta grafica se puede observar de una mejor forma el crecimiento de los microorganismos existentes en las muestras y controles, resaltando que las tres muestras se presento una disminución en el numero de microorganismos existentes y con respecto al control positivo la disminución de la población o se ve tan afectada esperando un aumento en su crecidito debido a que este alcanza su mayor tasa de crecimiento después de un mes.
Cuadro 3:
La finalidad de la elaboración de la cromatografía por capa fina fue la de poder identificar los compuestos existentes en la muestra de petróleo empleada para los diferentes tratamientos, utilizando como fase móvil el benceno ya que se tiene como referencia es que permite el mejor porcentaje de extracción de los alcanos (C-16, C-40). Todas las cromatografías se revelaron utilizando la cámara de luz UV con longitud de onda larga y corta. Obteniendo mejores resultados en la longitud larga.


n-alcanos

Distancia del compuesto (cm)

Distancia de frete (cm)

Rf (cm)

Mezcla de compuestos (petróleo)

7.35

6.43

1.4

.72

8

.9187

.8037

.175

.09

N-heptano

1.38


8

.1725

N-hexano

.68


8

.085


Imagen 1:

Imagen 2:



Petróleo


n-Heptano



n-Hexano




1º cromatografía revelada con longitud de onda larga, en la que se colocaron lasn-hexano, n-heptano y petróleo.

1º cromatografía revelada con longitud de onda corta, en la que se colocaron lasn-hexano, n-heptano y petróleo.

Cuadro 4:


n-alcanos

Distancia del compuesto (cm)

Distancia de frete (cm)

Rf (cm)

Mezcla de compuestos (petróleo)

7.35

6.43

1.4

.72

10

.735

.643

.140

.072

N-heptano

1.38


10

.138

M1

.78


10

.078

M2


1.26

10

.0126

M3


.54

10

.054


Imagen 3: Imagen 4:

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m2

n-Heptano




m1



Petróleo




m3




2º cromatografía revelada con longitud de onda larga, en la que se colocaron las tres muestras, n-heptano y petróleo.

2º cromatografía revelada con longitud de onda corta, en la que se colocaron las tres muestras, n-heptano y petróleo.



Esta segunda cromatografía tuvo la finalidad de detectar de una forma indirecta la degradación de los n-alcanos presentes en las tres diferentes muestras, observando que en los tratamientos M1 y M3 presentan una disminución en los n-alcanos.
DISCUSIÓN:
Los n-alcanos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza principalmente de diesel, aceite y petróleo ya sea crudo o refinado siendo este ultimo el más difícil de degradar. La contaminación del agua por hidrocarburos (derramas de petróleo) provocan un desequilibrio al aumentar la cantidad de carbono, lo que descompensa los niveles de nitrógeno y fosfato, en esas condiciones metabólicas no se puede consumir el carbono, la biorremediación de petróleo puede consistir en verter los mismos nutrientes que están descompensados, fosfato y nitrógeno y dejar que los microorganismos que ya están presentes “hagan su trabajo”.

Los derrames de petróleo forman una mezcla de hidrocarburos los cuales se solidifican formando una capa gruesa difícil de degradar (Salvareyre et. al. 1998) la cual impide el intercambio de gases y cambios, ocasionando un impacto negativo en el ecosistema.

  • Utilización y degradación de n-alcanos

Los avances han permitido la comprensión del catabolismo microbiano, evaluando los mecanismos bioquímicos los cuales controlan las respuestas microbianas con respecto a los sustratos de hidrocarburos. Estos aspectos incluyen cambios en la maquinaria de la membrana, la capacitación activa, salida de los hidrocarburos y una quimiotaxis. También la interacción de diversos factores, incluyendo nutrientes, el estado físico de los hidrocarburos, el oxigeno, temperatura, salinidad y presión, influyen en un aumento o disminución de la biorremediación de n-alcanos.

La medición de la degradación de los n-alcanos en el presente proyecto se realizo de una forma indirecta, utilizando como referencia el número de microorganismos existentes en nuestros distintos tratamientos (M1, M2, M3) a lo largo de tres semanas y el empleo de una cromatografía de capa fina en la cual se corrió los residuos de los tratamientos y el control negativo.

  • Metabolismo

El efecto degradador que presentaron los tratamientos M1 y M3 observar imagen 3 y 4 se debe al metabolismo que presentaron los microorganismos existentes en estos tratamientos ya que estudios han demostrado que un solo microorganismo puede activar varios genes que pueden codificar para las diferentes enzimas que desempeñan funciones similares (Van Hamme, et.al. 1996) en este caso la degradación de n-alcanos.

Uno de los genes mas extensamente descrito y caracterizado para la degradación de n-alcanos es codificado por el plásmido octubre, presente en Psedomona aeruginosa (control positivo) el cual activa la síntesis de enzimas para derivar los electrones a través de NADH a la hidrolasa para la conversión de un alcano en un alcohol, este se puede oxidar a un aldehído y ácido antes de preceder a la oxidación (entrada al ciclo del ácido tricarbixilico) (Grimm, A. C., and C. S. Harwood. 1997).

Otro modelo empleado para el metabolismo de n-alcanos es la regulación de los genes ALK. Aquí el operón ALK-BFGHJKL codifica las enzimas necesarias para la conversión de los alcanos en acetil-coenzima (Grimm, A. C., and C. S. Harwood. 1999).

La expresión de lo os genes ALKM, RUBA y RUBB presentes en Acinetobacter, está controlada por la n-longitud de la cadena de alcanos, factor importante para la degradación de residuos de petróleo, ya que se ha demostrado que el crecimiento de las cepas en medios con n-alcanos mayores a 30 átomos de carbono disminuye notablemente, lo cual puede deberse básicamente a que el transporte de una cadena larga es más difícil que el de cadenas medianas y requiere más energía (Salgado Brito R., et. al. 2008)

Todos estos mecanismos ya antes mencionados, probablemente existentes en los microorganismos de cada tratamiento empleado.

  • Dinámica de la comunidad microbiana

El uso de microorganismos obtenidos de aguas contaminadas, me permitió saber que estos poseen una maquinaria metabólica capaz de permitir el uso de diversos compuestos como fuente de carbono y energía debido a la alta competitividad que presentan estos organismos en su medio ambiente, además que los microorganismos capaces de metabolizar hidrocarburos son ampliamente distribuidos (Van Hamme, et.al. 2003).

En los intentos de caracterizar las comunidades microbianas naturales afectadas por los hidrocarburos, se ve agravada por las grandes cantidades de sustratos individuales y las interacciones entre los posibles metabolismos (Van Hamme, et.al. 2003).

La capacidad para la degradación de n-alcanos por las muestras utilizadas (figura 3) a demás de existir una participación de cada una de las posibles cepas existentes, puede presentarse una interacción microbiana (consorcio) que se pudiera presentar en el entorno, jugando un papel importante para la aceleración de la degradación, pero por la dificultad de poder cultivar los microorganismos, es difícil saber el papel de las cepas presentes en la comunidad y su contribución a la degradación.

Se ha demostrado que la eficiencia de las comunidades microbianas autóctonas como degradadoras de n-alcanos presenta un mejor resultado (oxidativa, mineralizarte o enzimático) que las hechas en laboratorio (Thouand, G., et. al. 1999).

CONCLUSIÓN:

  • En el tratamiento M1 y M3 es posible la existencia de microorganismos capaces de degradar n-alcanos, debido a las diferencias encontradas en la cromatografía de capa fina.

  • Todos los microorganismos presentes al final del experimento probablemente posean capacidad degradadora de n-alcanos ya que fueron capaces de sobrevivir un lapso de tiempo de tres semanas lo que solo podría ocurrir si poseen un metabolismo adecuado para la utilización de n-alcanos.

  • No existe activada degradadora en el tratamiento M2 ya que siendo uno de los tratamientos con un mayor número de microorganismos presentes su número se redujo a un nivel insignificante.

  • La interacción de los distintos microorganismos juega un papel importante en la degradación de n-alcanos, probablemente ocasionado una aceleración en la degradación.

  • La relación entre la energía que se necesita para transportar y oxidar un n-alcano y la energía producida por su degradación, podría ser la explicación de la diferencias en la velocidad de crecimiento de las bacterias presentes en cada tratamiento.




REFERENCIAS:

  • “APLICACIÓN DE SISTEMAS DE BIORREMEDIACIÓN DE SUELOS Y AGUAS CONTAMINADAS POR HIDROCARBUROS, GEOCISA”.MAROTO ARROYO, Mª ESTHER Y ROGEL QUESADA, JUAN MANUEL. DIV. PROTECCIÓN AMBIENTAL DE SUELOS.



  • “AKANE HYDROXYLASE FROM ACINEBACTER SP. STRAIN ADP-1 IS ENCODED BY aklM AND BELONGS TO A NEW FAMILY OF BACTERIAL INTEGRAL MEMBRANE HYDROCARBON HYDROXILASES” (1998), RATAJCZAK, A., GEIBDORFER, W. Y HILLER, W., APPL. ENVIRON. MICROBIOL.



  • “BIODEGRADATION OF PETROLEUM HYDROCARBONS BY PSYCHROTROPHIC” (1997), LYLE G. WHYTE, LUC BOURBONNIE`RE, AND CHARLES W. GREER, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY




  • “CHEMOTAXIS OF PSEUDOMONAS SP. TO THE POLYAROMATIC HYDROCARBON NAPHTHALENE” (1997), GRIMM, A. C., AND C. S. HARWOOD. APPL. ENVIRON. MICROBIOL.



  • “DEGRADACIÓN DE N-ALCANOS POR PSEUDÓNIMA AERUGINOS MGP-1” (2008), SALGADO BRITO R., PINEDA FLORES G., MESTA HOWARD A. M., DÍAZ CEDILLO F., EN TAO WANG HU. UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR, IPN.




  • “FIELD EVALUATIONS OF MARINE OIL SPILL BIOREMEDIATION” (1996), RICHARD P. J. SWANNELL, KENNETH LEE, AND MADELEINE MC DONAGH NATIONAL ENVIRONMENTAL CANADA.



  • “LABORATORY EVALUATION OF CRUDE OIL BIODEGRADATION WITH COMMERCIAL OR NATURAL MICROBIAL INOCULA”. (1999), THOUAND, G., P. BAUDA, G. OUDOT, G. KIRSCH, C. SUTTON, AND J. F. VIDALIE.

CAN. J. MICROBIOL.


  • “MICROBIAL DEGRADATION OF PETROLEUM HYDROCARBONS: ANENVIRONMENTAL PERSPECTIVE” (1981), DEPARTMENT OF BIOLOGY, UNIVERSITY OF LOUISVILLE, LOUISVILLE, KENTUCKY




  • “NAHY, A CATABOLIC PLASMID-ENCODED RECEPTOR REQUIRED FOR CHEMOTAXIS OF PSEUDOMONAS PUTIDA TO THE AROMATIC HYDROCARBON NAPHTHALENE” (1999), GRIMM, A. C., AND C. S. HARWOOD. J. BACTERIOL.




  • PSEUDOMONAS STRAINS POSSESSING BOTH ALKANE (ALK) AND NAPHTHALENE (NAH) CATABOLIC PATHWAYS” (1997), BIOTECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE, MONTREAL, QUEBEC, CANADA




  • “RECENT ADVANCES IN PETROLEUM MICROBIOLOGY”(2003), JONATHAN D. VAN HAMME,1 AJAY SINGH,2 AND OWEN P. WARD, DEPARTMENT OF BIOLOGICAL UNIVERSITY OF WATERLOO,WATERLOO, ONTARIO N2L 3G1,3 CANADA




  • “THE FATEOF PRETOLEUM IN SOIL ECOSYSTEMS”(1984), BOSSRT, I. BARTHA, R., IN R. M. ATLAS, PETROLEUM MICROBIOLOGY. NEW YORK.







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