Actividad práctica de laboratorio
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| Trabajo Práctico Nº 6 “DIAGNOSTICO DE BRUCELOSIS” Objetivos: - Conocer las principales características diagnósticas de la brucelosis bovina y caprina. - Realizar las pruebas de diagnóstico BPA, SAT y 2-ME. - Discutir la interpretación de los resultados. Actividades: - ACTIVIDAD PRÁCTICA DE LABORATORIO: Conocer y desarrollar la metodología para el procesamiento de las muestras en la determinación de las pruebas serológicas: BPA, SAT y 2-ME. Interpretación diagnóstica de los resultados. I. CONTENIDOS TEÓRICOS Los siguientes conceptos serán evaluados en el PARCIAL PRÁCTICO. Es muy importante concurrir al trabajo práctico con guardapolvo, barbijo y guantes. El siguiente texto ha sido adaptado de “BRUCELOSIS BOVINA”. Manual de la OIE sobre animales terrestres. Año 2008 y “Boletín Epidemiológico Periódico Nº33: Brucelosis”. Ministerio de Salud. República Argentina. Año 2009. 1. BRUCELOSIS BOVINA 1. 1 INTRODUCCIÓN La brucelosis es una zoonosis de importancia mundial. En humanos es también llamada Melitococcia, fiebre ondulante, fiebre de Malta o fiebre del Mediterráneo. En animales recibe el nombre de aborto infeccioso, aborto contagioso, aborto epizoótico y enfermedad de Bang en los bovinos. Causada por bacterias del género Brucella. Se trata de una infección considerada de riesgo ocupacional, incluida en la lista de las enfermedades profesionales, ya que no sólo se puede transmitir a través de la ingestión de productos lácteos contaminados y no pasteurizados. La atención de animales enfermos, la administración de vacunas a los animales, el trabajo en laboratorios y manipulación de productos, subproductos y desechos como tejidos o excreciones de animales enfermos son consideradas actividades ocupacionales de alto riesgo. En la cadena de transmisión el hombre es un huésped secundario, el cual resulta infectado a partir de una fuente animal que incluye a bovinos, caprinos, ovinos, porcinos o caninos infectados. El microorganismo atraviesa la barrera cutáneo-mucosa aún en ausencia de solución de continuidad de la misma. La manipulación de productos fetales, el contacto con el medio ambiente contaminado o actividades relacionadas pueden producir el contagio en el hombre. La Brucelosis tiene una distribución cosmopolita. Algunos países del centro y del norte de Europa han conseguido su erradicación pero permanece como un gran problema en las regiones Mediterráneas, Asia oeste, algunas zonas de África y América Latina. La incidencia de las diferentes especies es variable de una área a otra. En Sudamérica y en los países mediterráneos, tanto europeos como africanos, existen áreas endémicas de B. melitensis. El carácter zoonótico y las pérdidas económicas que ocasiona, son argumentos suficientes para generar actividades de control, eliminación y erradicación de la brucelosis. 1.2 AGENTE ETIOLOGICO El género Brucella corresponde a cocobacilos Gram negativos, inmóviles que no forman esporas. Estos microorganismos se observan al microscopio óptico como bacilos cortos de 0,5 a 0,7 μm de diámetro y de 0,5 a 1,5 μm de largo. La temperatura óptima de crecimiento es de 37 °C con un pH ácido de 6,6 a 7,4 en un ambiente aerobio. Muchas cepas de B. abortus y B. ovis requieren dióxido de carbono para desarrollarse y la mayoría de las especies crecen en forma lenta. Los miembros de este género son patógenos intracelulares facultativos capaces de infectar a una gran variedad de mamíferos. Actualmente se conocen seis especies entre las cuales se destacan: B. melitensis que parasita cabras y ovejas, B. abortus (ocho biovars) patógena de bovinos, B. ovis parasita ovejas, B. suis a cerdos, B. canis produce enfermedad en caninos y B. neotomae es patógena para ratas del desierto en el oeste de Estados Unidos. El hombre puede ser huésped secundario de B. melitensis, B. abortus, B. suis y B. canis. La evidencia genética e inmunológica indica que todos los miembros del género Brucella están estrechamente relacionados. Sin embargo, existen diferencias relevantes entre las principales variantes en cuanto a la preferencia por el hospedador y a la epidemiología, así como evidencias moleculares de variaciones genómicas. Los lipopolisacáridos de la pared celular de B. abortus, B. suis y B. melitensis tienen dos antígenos de superficie mayores (A y M), con predominio de A en B. abortus y M en B. melitensis. No producen exotoxinas, pero la pared celular contiene una exotoxina que se diferencia por la actividad biológica y estructura química de las endotoxinas producidas por muchos bacilos entéricos. Las reacciones cruzadas serológicas observadas entre especies de Brucella y Yersinia, Francisella tularensis, Vibrio cholerae y salmonelas se atribuye a las similitudes de las cadenas laterales O- específicas de los residuos polisacáridos de estos microorganismos. 1.3 EPIDEMIOLOGIA: En la Argentina se conoce la infección con B. abortus (ganado bovino), B. ovis (ganado ovino), B. melitensis (ganado caprino) y, en menor grado, B. suis (cerdos) y B. canis (perros). En el ganado vacuno la brucelosis suele estar causada por biovariedades de Brucella abortus. En algunos países, donde el ganado bovino se cría junto a ovejas o cabras, la infección también puede ser debida a B. melitensis. En ocasiones, B. suis puede causar una infección crónica de las mamas en el ganado vacuno, pero no se ha descrito que origine abortos o se extienda a otros animales. Normalmente la enfermedad es asintomática en las hembras no gestantes. La aparición de la enfermedad es más común en primavera y verano que en otoño e invierno. Los mamíferos en estado de preñez o sexualmente maduros son más susceptibles porque este microorganismo tiene afinidad por los tejidos de los órganos reproductivos, siendo la infertilidad o el aborto uno de los principales signos de la brucelosis animal. Los animales infectados son la principal fuente de dispersión de la bacteria a través de sus secreciones genitales o mamarias como factor de contaminación. En el caso de los animales preñados, las bacterias se localizan en los tejidos placentarios, alcanzando concentraciones muy altas (alrededor de 1010 bacterias/ mL). Después de la infección por B. abortus o por B. melitensis, las hembras adultas en gestación desarrollan una placentitis que, por lo general, provoca el aborto entre el 5º y el 9º mes de gestación. Incluso en ausencia de aborto se produce una gran excreción de microorganismos a través de la placenta, los líquidos fetales y los exudados vaginales. Las mamas y los ganglios linfáticos regionales también pueden infectarse y los microorganismos pueden aparecer en la leche. Las gestaciones posteriores llegan, por lo general, a término, pero la infección uterina y la mamaria se repiten, con un número reducido de microorganismos en los productos del parto y en la leche. En las infecciones agudas, el microorganismo está presente en la mayoría de los ganglios linfáticos. Los machos adultos pueden desarrollar orquitis, y la brucelosis puede causar la esterilidad en ambos sexos. 1.3.1. Brucelosis Humana: El contagio del hombre puede ocurrir por tres vías: • Vía conjuntival o cutánea: es de interés desde el punto de vista profesional ocurriendo principalmente en trabajadores de laboratorio, o de servicios de salud y producida por el contacto directo entre tejidos, sangre o linfa. • Vía respiratoria: el contagio se produce por inhalación de aerosoles formados en operaciones, limpieza de establos, movimiento de ganado y en general todas las actividades que puedan movilizar el polvo infectado. • Vía digestiva: Es de importancia en cuanto al contagio no profesional de la enfermedad; éste ocurre al ingerir productos lácteos no pasteurizados o alimentos crudos contaminados con deyecciones de animales infectados. No existe contagio interhumano aunque se discute la transmisión sexual. Cadena epidemiológica de la Brucelosis - Vía cutáneo-mucosa  Las bacterias del género Brucella poseen la capacidad de fijarse e introducirse en las conjuntivas o en heridas de la piel. Una vez ingresadas al organismo avanzan por vía linfática hasta llegar al primer centro ganglionar, donde se multiplican, para posteriormente diseminarse a modo de septicemia, con especial afinidad por los órganos del sistema reticuloendotelial donde se localiza intracelularmente; evadiendo así los mecanismos de defensa celulares y humorales. De esta manera la bacteria se transporta dentro de los fagocitos, esparciéndose a diferentes órganos y causando la destrucción de las células que las transportan. La brucelosis humana puede manifestarse en forma subclínica, subaguda, aguda y crónica con un período de incubación de 7 a 21 días. El inicio suele ser insidioso con fiebre, escalofríos, diaforesis (excesiva sudoración), cansancio, anorexia y lumbalgia. Puede asociarse también a cefaleas, mialgias, odinofagia, tos, estreñimiento y pérdida de peso. Existen adenopatías en el 50% de los casos agudos y esplenomegalia en un 30%. La infección puede localizarse y ocurrir entonces osteomielitis, artritis, abscesos esplénicos, orquiepididimitis y endocarditis. En caso de desarrollarse en forma crónica el paciente puede presentar febrículas, astenia, pérdida de peso, ansiedad o depresión. En nuestro país es una enfermedad de notificación obligatoria, sin embargo las estadísticas oficiales no reflejan el número real de personas infectadas, por lo que se estima que la verdadera incidencia sería de 10 a 25 veces más alta que la indicada. Los casos a menudo no son reconocidos y son tratados como “fiebre de origen desconocido” impidiendo esto el tratamiento oportuno y la intervención epidemiológica adecuada. 1.4 DIAGNÓSTICO:  El Servicio Nacional de Sanidad Animal (SENASA) resolvió establecer un Programa de Control y Erradicación de la Brucelosis Bovina en todo el país (Resolución 1269/93). El programa considera como pruebas oficiales de diagnóstico la prueba de BPA (Prueba en placa con antígeno bufferado) seroaglutinación en tubo (SAT o de Wright), 2-mercaptoetranol, rivanol y fijación del complemento. Los animales a muestrear serán los animales machos mayores a 6 meses de edad y las hembras de 18 meses con vacunación certificada. La prueba de BPA es utilizada como prueba tamiz. Es una prueba cualitaliva de aglutinación en placa que presenta la ventaja de ser realizada en una sola dilución. El resultado se expresa como POSITIVO o NEGATIVO. Los animales se clasifican como negativos o reaccionantes debiendo estos últimos ser sometidos a pruebas complementarias para su diagnóstico definitivo. Los sueros que resulten positivos al BPA serán procesados por la prueba de seroaglutinación (SAT) en tubos y 2 mercaptoetanol (2-ME). Otra alternativa para los sueros positivos a BPA es la prueba de Rivanol, pero reservada para utilizarse en lugares donde se carezca de laboratorios con suficiente infraestructura o cuando por condiciones de manejo no se pueda esperar los resultados por períodos de 72 horas. 1.4.1 PAPEL DEL DIAGNÓSTICO Y DE LA ELIMINACIÓN DE REACCIONANTES EN EL PROGRAMA DE CONTROL La base del Programa de Control y Erradicación de la Brucelosis Bovina es la siguiente: 1- vacunación obligatoria del 100 % de las terneras entre 3 y 8 meses de edad, 2- diagnóstico serológico realizado a partir de muestras extraídas por el Veterinario Acreditado en Laboratorios de la Red habilitados por el SENASA para tal fin y 3 - eliminación de los animales positivos. La vacuna Brucella abortus cepa 19 tiene un efecto antiabortivo considerable y confiere inmunidad de alto grado, pero no absoluta. La inmunidad que confiere puede ser vencida por una exposición masiva o por cepas de campo altamente virulentas. Es por ello que es conveniente además de vacunar reducir las fuentes de infección eliminando los animales reaccionantes. 1.4.2 INFLUENCIA DE LA VACUNACIÓN SOBRE EL DIAGNÓSTICO. La vacunación tiene indudables ventajas pero también algunas desventajas. El inconveniente mayor es que la vacuna induce la formación de anticuerpos que pueden confundir el diagnóstico. Para contrarrestar este inconveniente es que se debe vacunar entre los 3 y 8 meses de edad. Cuanto más joven es el animal, menor tiempo retiene los anticuerpos debido a la vacunación. Las hembras vacunadas a los 3 meses se vuelven negativas dos meses después de la vacunación, en cambio las vacunadas a los 6 meses tardan 6 meses y las vacunadas a los 9 meses (fuera de la edad permitida) mantienen la clasificación de sospechosa 15 meses después de la vacunación. En términos generales se puede afirmar que el 95 % de las hembras vacunadas entre los 3 y 8 meses se negativizan a la edad de 2 años. Otro aspecto es la infección residual por la vacuna. La cepa 19 produce en general un proceso de infección de corta duración en los animales vacunados. Sin embargo en algunos animales se ha podido comprobar una infección duradera y persistente en el tejido mamario, con aislamiento de la cepa vacunal en leche. Estos animales no pueden distinguirse de los infectados por cepas a campo mediante pruebas serológicas. Afortunadamente la proporción de estos animales es muy baja 2-3 /100.000 terneras vacunadas. Las pruebas serológicas dan una evidencia indirecta de la infección brucélica, que cuando son efectuadas en forma uniforme y se las interpreta con criterio epidemiológico constituyen el instrumento más práctico para el diagnóstico. Para poder interpretar debidamente el resultado del diagnóstico es necesario conocer la dinámica de la evolución de los anticuerpos anti-brucela, la evolución de las inmunoglobulinas específicas después de la infección con una cepa virulenta de campo así como después de la vacunación con la cepa 19. 1.4.3 INMUNOGLOBULINAS EN BRUCELOSIS El término inmunoglobulinas comprende las proteínas que poseen actividad de anticuerpo. Las principales inmunoglobulinas (Ig) que nos conciernen en Brucelosis son la M y la G. Se reconocen en el bovino dos subclases de IgG: la IgG 1 y la IgG 2. La IgG 1 es la más abundante en el suero y secreciones lácteas mientras que la IgG 2 se encuentra en concentraciones más bajas, pero puede aumentar en determinadas circunstancias. La IgA fue poco estudiada en Brucelosis. 1.4.3.1 Principales características de las inmunoglobulinas: Las inmunoglobulinas IgM e IgG (ver figuras) se diferencian entre otras características por su peso molecular, constante de sedimentación, estabilidad al calor, movilidad electroforética, resistencia al mercaptoetanol, precipitación por rivanol (un compuesto de la acridina) e inhibición por pH bajo.  Figura Esquemática de la Inmunoglobulina G. La IgG es producida y secretada por las células plasmáticas del bazo, los gánglios linfáticos y la médula ósea. Es la inmunoglobulina de mayor concentración en la sangre, por lo que desempaña la función más importante en los mecanismos de defensa mediados por anticuerpos. Posee dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas gamma. Las cadenas ligeras son de tipo lamda o kappa, puesto que es la inmunoglobulina más pequeña.  Figura Esquemática de la Inmunoglobulina M. La IgM también es producida y secretada por células plasmáticas en el bazo, los gánglios linfáticos y la médula ósea. Cuando se localiza en la superficie de la célula B es un monómero de 180 kDa. Sin embargo cuando se secreta es un polímero que consta de 5 (a veces 6) subunidades de 180 kDa enlazadas en un círculo por puentes de disulfuro, Su peso molecular es de 900 kDa. Un pequeño polipéptido rico en cisteína denominado cadena J, une a dos de las unidades para completar el círculo. Cada uno de los monómeros de IgM tiene la estructura de una inmunoglobulina convencional, es decir consta de dos cadenas ligeras kappa o lambda y dos cadenas pesadas mu. 1.4.3.2 Evolución de las inmunoglobulinas en animales vacunados e infectados: La vacunación con la cepa 19 estimula la aparición de IgM al cabo de unos 5-7 días y alcanzan su máxima concentración a las 2-3 semanas. Luego su concentración en el suero va reduciéndose pero sin desaparecer durante varios meses. Las IgG aparecen casi al mismo tiempo, o algo más tarde, y alcanzan su máxima concentración de 28 a 42 días después de la vacunación. Estas inmunoglobulinas desaparecen más rápidamente que las IgM, perdurando unos 6 meses después de la vacunación de terneras jóvenes. La infección natural con cepas de Brucella abortus virulentas va seguida de la formación de IgM e IgG, pero la concentración de IgM declina, mientras que la IgG tiende a persistir todo el tiempo que el animal está infectado. En animales con Brucelosis crónica la IgG es la inmunoglobulina principal y a veces la única detectable. En consecuencia, la diferencia principal entre animales vacunados e infectados es la perdurabilidad de la IgG en estos últimos. En el conocimiento de estos hechos inmunológicos se basan las pruebas del 2 mercaptoetanol, Rivanol, Fijación de Complemento y otras. 1.4.3.3 Representación gráfica de la relación entre la edad de vacunación y el nivel y persistencia de IgG: La vacunación de terneras con cepa 19 es obligatoria para todos los rodeos del país. En los rodeos donde se está en proceso de erradicar la infección o ya fue erradicada, interesa evitar al máximo la interferencia que puedan tener los anticuerpos originados por la vacunación con el diagnóstico de la enfermedad. Anteriormente se expresó que cuanto más joven es el animal a vacunar más rápidamente desaparecen los anticuerpos post-vacunales. Veamos la relación del tenor y persistencia de los anticuerpos IgM e IgG en relación a la edad de vacunación. Las figuras 1 y 2 muestran gráficamente la diferencia en el aspecto mencionado, cuando se vacunan terneras de 4 a 6 meses ó de 8 meses de edad.   Según se puede observar, los anticuerpos a títulos significativos no solo desaparecen más rápidamente en terneras vacunadas entre 4 y 6 meses de edad, sino que el nivel de la IgG es mucho menor y menos persistente que cuando se vacunan animales a los 8 meses y con mayor edad. Vacunando a edad temprana no solamente se reduce el riesgo de títulos persistentes a la prueba de seroaglutinación, sino también a las pruebas complementarias. De ahí la recomendación de vacunar a temprana edad en los establecimientos donde se está erradicando la brucelosis. 1.4.3.4 Pautas de IgM e IgG en animales infectados no vacunados y vacunados: Cuando un animal es infectado naturalmente, aparecen primero los anticuerpos IgM y al poco tiempo las IgG. En la figura 3 vemos un ejemplo de una vaquillona no vacunada y expuesta a una cepa virulenta.  Este animal generó primero anticuerpos de la clase IgM. Durante el curso de la infección empezaron a predominar las IgG y mantuvieron un nivel más alto que las IgM. Si bien esta figura representa solo un animal y las pautas de la seroaglutinación pueden variar en diferentes individuos, de acuerdo a la dosis de exposición y vía de inoculación, el ejemplo ilustra bien que las IgM se forman como una respuesta específica y son importantes para el diagnóstico, especialmente al principio de la infección. Cuando una hembra vacunada se infecta por una cepa virulenta, los anticuerpos IgG reaparecen más pronto debido a la memoria inmunológica. En las pruebas de seroaglutinación predominan la reacción con las IgM. Las IgG 1 e IgG 2 difieren en su actividad. La IgG 1 tiene poco poder aglutinante, mientras que la IgG 2 es más activa en la prueba. 1.4.3.5 Los "FALSOS POSITIVOS" en las pruebas de seroaglutinación: Los "falsos positivos" en las reacciones se deben a varias causas, tales como anticuerpos residuales por la vacunación con cepa 19 y reacciones cruzadas debidas a anticuerpos originados por bacterias que tienen lipopolisacáridos superficiales similares a los de Brucella. Ya se dijo que hay una pequeña proporción de animales, especialmente los vacunados a una edad tardía, que puede mantener anticuerpos aglutinantes que persisten durante mucho tiempo. Las reacciones en estos casos se deben a la inmunoglobulina M, ya que la IgG 2 generalmente desaparece rápidamente y la IgG 1 es poca activa en la prueba y además su concentración se reduce al poco tiempo después de la vacunación. El origen de muchas reacciones inespecíficas del bovino no se conoce. Sin embargo se sabe que algunas salmonellas dan reacciones cruzadas. Se ha comprobado que hay una relación antigénica entre Brucella y Escherichia coli y con Yersinia enterocolítica. 1.4.3.6 Los "FALSOS NEGATIVOS" en las pruebas de seroaglutinación: Los "falsos negativos" en las pruebas de aglutinación se presentan durante el período de incubación es decir desde la exposición a la infección hasta la aparición de las aglutininas. En hembras expuestas por primera vez a la infección durante la gestación es frecuente que las aglutininas aparezcan varios días a dos semanas después del aborto o del parto. Además hay animales infectados que nunca alcanzan un título aglutinante significativo. De especial interés son algunos animales con infección crónica, que se encuentran en los llamados "rodeos problema" y en los cuales las IgM han bajado a un nivel no diagnóstico y casi todos los anticuerpos están constituídos por IgG. Estos animales pueden ser reconocidos por las pruebas complementarias. La figura 4 ilustra los resultados de seroaglutinación de algunas vacas de "rodeos problema".  Los animales sospechosos a la prueba de aglutinación deben ser examinados en la próxima prueba general del rodeo, o si es posible antes, con el fin de clarificar su estado frente a la infección sobre la base del aumento, estabilidad o reducción del título. Si el título se incrementa es indicación que el animal está enfermo; si disminuye, se le otorga la clasificación de negativo. Más difícil es decidir sobre los animales con títulos estables del rango de sospechoso, que deberán ser eliminados o sometidos a pruebas complementarias. 1.4.4 ASPECTOS IMPORTANTES EN EL DIAGNÓSTICO 1.4.4.1 El período de incubación en la brucelosis bovina: Uno de los grandes problemas en la lucha contra la brucelosis es el período prolongado y variable de incubación. El diagnóstico serológico se basa en la detección de anticuerpos humorales. Bajo las condiciones naturales de campo el intervalo entre la exposición a la infección y la aparición de anticuerpos varía ampliamente. La experiencia ha demostrado que los principales factores que influyen en el periodo de incubación tanto serológica (desde la infección hasta la detección de anticuerpos a un título significativo) como clínica (desde la infección hasta el aborto) son principalmente: a) dosis de exposición. b) virulencia de la cepa. c) tiempo de preñez. d) resistencia individual del animal. En una experiencia realizada en Inglaterra con dosis diferentes de una cepa virulenta el rango de variación del período de incubación fue de 14 a 227 días correspondiendo el periodo más corto a la dosis más alta y el más largo a la dosis menor. El período tan variable de incubación serológica tiene implicancias en el diagnóstico de animales individuales y en la erradicación de la infección de un rodeo. 1.4.4.2 El diagnóstico en los animales individuales: El período variable de incubación explica la poca confiabilidad que tiene el diagnóstico serológico en los animales individuales, si no proceden de rodeos libres de brucelosis. Un animal individual con reacción negativa a una prueba o aún a una combinación de pruebas, no ofrece garantías si procede de un rodeo infectado, ya que puede haber sido expuesto a la infección y encontrarse en el período de incubación. Por consiguiente es recomendable que el animal adquirido con un diagnóstico negativo de brucelosis sea mantenido en aislamiento unos 90 días y luego sometido a un nuevo examen. 1.4.4.3 Influencia del período de incubación sobre el proceso de erradicación de la brucelosis en un rodeo. En consideración al período de incubación, es necesario repetir las pruebas en todos los animales para asegurar que no se deja un animal infectado que puede servir luego de fuente de infección al resto del rodeo. Es importante que la repetición de las pruebas se haga con intervalo fijo de 60-90 días para no dejar tiempo a que la infección se siga propagando. Teniendo en cuenta también que el periodo de incubación puede ser muy prolongado no se debe otorgar la certificación de rodeo libre en menos de 6-9 meses después de la última prueba negativa del total del rodeo. 1.4.4.4 El diagnóstico en hembras preñadas y paridas: Se ha observado que un número de hembras infectantes no desarrollan anticuerpos IgG hasta el parto o 1 a 3 semanas después. Estos animales pueden tener títulos bajos de IgM unas semanas antes, pero en un rodeo vacunado con cepa 19 no hay manera de decidir si se debe a la vacunación o a una infección reciente. Es posible que este fenómeno se deba al periodo de incubación cuando los animales son expuestos a la infección en los últimos meses de la preñez. La recomendación que se deriva de este hecho es la necesidad de repetir las pruebas a las 2-3 semanas después del parto o aborto, si las realizadas anteriormente resultaron negativas. 1.4.4.5 El diagnóstico con referencia a edad y sexo: En los programas de erradicación se exceptúan del diagnóstico bovinos menores de 6 meses de edad. Si bien estos animales pueden infectarse por el calostro y la leche, la infección se acantona en los ganglios y se elimina espontáneamente en la mayoría de los casos. Últimamente se ha demostrado que un número no determinado pero pequeño de terneros que nacen de vacas infectadas pueden haberse infectado intrauterinamente y mantenido una infección latente, sin respuesta inmunológica, revelándose la enfermedad recién durante la primera parición o aborto, cuando acusan reacciones serológicas. |
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